培養(yǎng)角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞構(gòu)建角膜后板層的研究.pdf

1、角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過“泵-漏”機制和物理屏障功能保證角膜的正常厚度和透明度。穿透性角膜移植和后板層角膜移植是治療角膜內(nèi)皮細(xì)胞失代償?shù)闹饕椒?，但是受到供體來源缺乏等問題的限制。體外構(gòu)建角膜后板層替代損傷的角膜內(nèi)皮是目前研究的熱點。 目的：分離培養(yǎng)貓角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞并誘導(dǎo)多向分化。將角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞接種于豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)，體外構(gòu)建角膜后板層。 方法：膠原酶聯(lián)合胰酶消化法分離培養(yǎng)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，對角膜內(nèi)皮細(xì)胞周期及體外增殖能力進

2、行分析；用平板克隆形成試驗分離培養(yǎng)角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞并鑒定；培養(yǎng)角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并對前體細(xì)胞進行成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)；1％Triton X-100聯(lián)合通風(fēng)干燥法制備豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)載體，將角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞接種于載體，體外構(gòu)建角膜后板層，進行形態(tài)學(xué)和組織學(xué)檢測。 結(jié)果：應(yīng)用膠原酶聯(lián)合胰酶消化法，每片角膜可以得到1×105～2×105個角膜內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)5天細(xì)胞可以融合成片,連續(xù)傳代8次形態(tài)活力良好。（78.14±3

3、.28）％的角膜內(nèi)皮細(xì)胞停留于G1期，外周角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力強于中央。平板克隆形成試驗得到的角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞呈克隆樣生長，外周和中央角膜的克隆形成率分別為（0.102±0.02）％和（0.054±0.03）％，克隆表達(dá)nestin。形成克隆的細(xì)胞傳代后克隆形成率下降。角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞可以分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，表達(dá)AQP-1和ZO-1；經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ALP合成增多，表達(dá)Ⅰ型膠原和骨鈣素，形成礦化結(jié)節(jié)；成軟骨誘導(dǎo)后沒有形成軟骨陷窩，不表達(dá)Ⅱ

4、型膠原，部分細(xì)胞外基質(zhì)被阿利辛藍(lán)異染；成脂誘導(dǎo)后沒有出現(xiàn)脂滴，油紅O染色陰性。構(gòu)建的角膜后板層由角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞和脫細(xì)胞基質(zhì)載體構(gòu)成，載體透明，結(jié)構(gòu)致密，無細(xì)胞成分殘留，前體細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞，形成連續(xù)的單層，細(xì)胞與載體貼附緊密，構(gòu)建的后板層結(jié)構(gòu)與正常角膜后板層組織相似。 結(jié)論：膠原酶聯(lián)合胰酶消化法可以得到大量的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。角膜內(nèi)皮細(xì)胞中存在前體細(xì)胞，角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞具有較強的增殖能力、一定的自我更新能力和分化能力。以豬角膜脫