脫細胞角膜基質聯(lián)合內皮樣細胞構建生物工程角膜后板層的實驗研究.pdf

1、角膜病致盲率位居全球第二，同時它也是國內第二大致盲眼病。同種異體角膜移植是目前治療不可逆性角膜盲最有效的方法，但角膜供體來源的極度匱乏使其應用受到了限制。生物工程角膜材料來源豐富，生物相容性好，因此能夠有效地緩解天然角膜極其匱乏的壓力，社會意義重大，經濟效益顯著。
　　 生物工程角膜的構建是將體外擴增的種子細胞（包括角膜上皮細胞、基質細胞和內皮細胞）種植于支架材料上，經過體外三維培養(yǎng)形成與天然角膜在結構和功能上相似的角膜植片替代

2、物。支架材料和種子細胞是兩大關鍵要素，也是目前生物工程角膜研究的熱點和難點。
　　 目前大部分支架材料因生物相容性、透明度或機械強度的不足而僅限于組織學、生理、病理、毒理、藥理及角膜損傷等方面的基礎研究。我們課題組前期研制的脫細胞豬角膜基質(acellularporcinecornealmatrix，APCM)，所含異種細胞及遺傳物質被完全脫除，其天然膠原排列結構得到了的保留，具有良好的透光性、機械力學性能以及生物相容性，并已成

3、功應用于兔角膜前板層的構建。但是APCM是否能夠支持角膜內皮細胞的生長并且形成功能性的角膜內皮結構，仍是目前研究的空白。生物工程角膜內皮的構建可為角膜內皮細胞相關性的基礎研究提供良好的體外模型，也可為今后全層生物工程角膜的研制奠定技術基礎，同時還可成為臨床上單純角膜內皮移植手術潛在的供體植片來源，具有較高的研究價值和意義。
　　 生物工程角膜內皮的構建需要充足的內皮細胞供給，人類角膜內皮細胞缺乏增殖能力，難以在體外大量擴增培養(yǎng)，

4、因此尋找新的內皮細胞來源成為亟待解決的問題。目前由于尚未找到理想的內皮細胞來源，大部分有關生物工程角膜內皮構建的研究都是利用增殖能力相對較強的低等動物的角膜內皮細胞或永生化人角膜內皮細胞系等，此類生物工程角膜內皮可用于體外實驗研究，但是尚難以滿足臨床應用的要求。神經嵴干細胞是角膜內皮細胞的前體細胞，其來源充足（可在體外由胚胎干細胞誘導分化而來），如能將其誘導分化為角膜內皮細胞，將為生物工程角膜內皮的構建提供新的內皮細胞來源。
　　

5、 鑒于以上問題，本研究首先以后板層APCM為支架，探討了其與人角膜內皮細胞的生物相容性，證實后板層APCM支架可支持人角膜內皮細胞系B4G12的生長，并形成具備一定泵功能的生物工程角膜內皮，可作為良好的人角膜內皮體外模型而應用于基礎研究;其次，本研究探討了將大鼠神經嵴干細胞誘導分化為角膜內皮細胞的可行性，篩選出成功的誘導方案，獲得了在形態(tài)和功能上接近正常角膜內皮細胞的角膜內皮樣細胞;最后，我們利用后板層APCM支架、角膜內皮樣細胞及原

6、代培養(yǎng)的角膜基質細胞構建了無上皮生物工程角膜，并初步嘗試進行動物穿透性角膜移植實驗，結果顯示術后植片上皮可自我修復，并且植片具備一定的內皮泵功能，病理染色顯示植片基質內有大量炎細胞樣細胞浸潤，提示出現免疫排斥反應，今后在植片的構建方法、實驗動物的選擇及手術操作方法等方面尚需改善。
　　 第一部分，利用后板層APCM支架和人角膜內皮細胞系構建角膜內皮體外模型的實驗研究
　　 目的：探討以后板層APCM為支架，以人角膜內皮細

7、胞系為種子細胞構建角膜內皮體外模型的可行性。
　　 方法：1.后板層APCM支架的制備:無菌條件下板層分離新鮮豬角膜，留取約1/2厚度的后板層組織，用含有1％青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液充分洗滌后將其置于0.5％無菌SDS溶液中于4℃條件下脫細胞24小時。隨后用無菌磷酸鹽緩沖液充分漂洗脫細胞后的組織，于-20℃條件下凍干12小時，生物安全柜內自然風干3小時，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.后板層APCM支架的形態(tài)和細胞毒性

8、檢測:HE染色檢測后板層APCM中細胞脫除情況，MTT法檢測后板層APCM浸提液對人角膜內皮細胞系增殖活性的影響。
　　 3.人角膜內皮細胞B4G12的培養(yǎng):用層粘連蛋白與硫酸軟骨素混合液包被培養(yǎng)瓶底壁，于常規(guī)條件下用含有人重組堿性成纖維細胞生長因子的人內皮細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)B4G12細胞，0.05％胰酶-0.02％EDTA常規(guī)消化傳代。
　　 4.生物工程角膜內皮的構建:解剖顯微鏡下切取直徑約為8mm、厚度約為1mm

9、的后板層APCM，將其置于B4G12細胞培養(yǎng)基中于37℃浸泡24小時后，后彈力層面向上將其置于24孔板內，自然風干表面。調整B4G12細胞接種密度為2000個/mm2，將細胞懸液輕輕滴于APCM后彈力層面，待細胞貼附后補足培養(yǎng)基至整個APCM支架上表面被浸沒。對所構建生物工程角膜內皮進行掃描電鏡檢測，臺盼藍-茜素紅S雙染色、HE染色、免疫熒光染色檢測閉鎖小帶蛋白-1(zonulaoccluden-1，ZO-1)、Na+/K+ATP酶的表

10、達情況以及角膜腫脹實驗檢測內皮泵功能。
　　 結果：HE染色顯示后板層APCM支架中細胞及遺傳物質成分被完全去除，膠原排列結構及后彈力層保留完好。MTT實驗結果證實后板層APCM浸提液對B4G12細胞生長曲線無影響(P＞0.05)。B4G12細胞種植于后板層APCM支架后，臺盼藍-茜素紅S雙染色顯示多邊形細胞相互之間連接緊密，形成完整的單細胞層覆蓋APCM后彈力層面，平均細胞密度為2061±344個/mm2。HE和DAPI染色證

11、實僅在APCM后彈力層面有單層細胞結構，而APCM基質中不含有任何細胞及其核物質。免疫熒光染色顯示B4G12細胞在APCM支架上表達功能相關性蛋白ZO-1和Na+/K+ATP酶。角膜腫脹實驗結果顯示Na+/K+ATP酶抑制劑烏巴因可誘發(fā)角膜基質水腫，使得角膜基質厚度增加51.7％，而不含烏巴因組僅產生可逆性的角膜基質水腫，從而間接證明所構建生物工程角膜具有一定的泵功能。
　　 結論：利用后板層APCM支架和B4G12構建的生物工

12、程角膜內皮具備與天然角膜內皮類似的結構與功能，可作為內皮相關性研究良好的體外模型。
　　 第二部分：大鼠神經嵴干細胞誘導分化為角膜內皮樣細胞的實驗研究
　　 目的：探討體外誘導大鼠神經嵴干細胞分化為功能性角膜內皮樣細胞的可行性。
　　 方法：1.大鼠神經嵴干細胞的原代培養(yǎng)及鑒定:取9天孕齡大鼠胚胎，從背側暴露神經管，用細針頭挑取前十個體節(jié)的神經管組織，將其置于事先由纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，48小時后去

13、除神經管組織，繼續(xù)培養(yǎng)已遷移出的神經嵴干細胞，0.05％胰酶-0.02％EDTA常規(guī)消化傳代;免疫熒光實驗檢測神經嵴干細胞標記物P75和HNK-1的表達。
　　 2.大鼠角膜內皮細胞的原代培養(yǎng):取新鮮大鼠角膜，充分漂洗后浸泡于培養(yǎng)基中于37℃過夜孵育以穩(wěn)定細胞活性;次日將浸泡有大鼠角膜的培養(yǎng)基離心，棄上清后加入0.02％EDTA，于37℃條件下消化1小時，輕輕吹打角膜以促進內皮細胞從后彈力層脫落;吹打完畢后離心棄上清，用內皮細胞

14、培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀，常規(guī)條件下培養(yǎng)。
　　 3.條件培養(yǎng)基的配制:待大鼠角膜內皮細胞生長至70％-90％滿時，每12小時提取一次細胞培養(yǎng)上清液，過濾后-80℃保存;將內皮細胞上清液與神經嵴干細胞培養(yǎng)基分別按照1∶3，1∶1和3∶1的比例混合，得到內皮細胞上清液濃度分別為25％、50％和75％的條件培養(yǎng)基。
　　 4.神經嵴干細胞的誘導分化及角膜內皮分化標記物的鑒定:
　　 分別用條件培養(yǎng)基法及細胞共培養(yǎng)法誘導

15、培養(yǎng)大鼠神經嵴干細胞，每日觀察細胞生長情況及形態(tài)變化，初步篩選出使神經嵴干細胞向角膜內皮細胞分化的方案后，對誘導細胞進一步進行角膜內皮細胞分化標記物的鑒定，具體實驗分組如下:
　　 1)條件培養(yǎng)基法:
　　 A:細胞外基質包被組:用層粘連蛋白和硫酸軟骨素包被6孔板底壁，分別用25％，50％和75％的條件培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)神經嵴干細胞;
　　 B:無包被對照組:對6孔板底壁不進行包被，分別用25％，50％和75％的條件

16、培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)神經嵴干細胞;
　　 2)細胞共培養(yǎng)法:
　　 A:細胞外基質包被組:用層粘連蛋白和硫酸軟骨素包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，將大鼠神經嵴干細胞與角膜內皮細胞按照1∶1，1∶5，1∶10及1∶20的數量比分別接種于Transwell小室的上室和下室內，進行共培養(yǎng)誘導;
　　 B:無包被對照組:不對Transwell小室聚碳酸酯膜進行包被，將大鼠神經嵴干細胞與角膜內皮細胞按照1∶1，1∶

17、5，1∶10及1∶20的數量比分別接種于Transwell小室的上室和下室內，進行共培養(yǎng)誘導;
　　 收集有陽性變化的誘導細胞，利用免疫熒光法檢測誘導細胞角膜內皮細胞分化標記物N型鈣粘素、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表達;利用流式細胞儀進一步檢測細胞誘導分化率;利用實時定量聚合酶鏈式反應(realtime-polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測角膜內皮分化相關基因FoxC1和Pitx2的表達。

18、r>　　 5.角膜內皮樣細胞動物移植:用液氮冷凍法制造角膜內皮功能不全大鼠模型，將角膜內皮樣細胞制成細胞懸液并用熒光染料標記后，調整細胞接種密度為3000個/mm2，利用前房注射的方法將角膜內皮樣細胞移植于術眼角膜的后彈力層面，以空白模型為對照組，術后定期進行裂隙燈觀察、激光共聚焦角膜顯微鏡觀察以及標本的組織學染色，評價角膜內皮樣細胞的體內功能和生物安全性。
　　 結果：神經管貼壁48小時后可見有纖維樣細胞從其周圍遷移出，免疫

19、熒光檢測顯示這些細胞同時表達神經嵴干細胞標記物P75和HNK-1，證實其為神經嵴干細胞。誘導實驗結果顯示，細胞外基質包被聯(lián)合75％條件培養(yǎng)基+10％胎牛血清誘導培養(yǎng)1周后，神經嵴干細胞出現形態(tài)變化，小部分細胞由纖維樣轉變?yōu)槎噙呅危?周后約有40％-50％的細胞發(fā)生形態(tài)變化，繼續(xù)延長誘導時間不能增加多邊形細胞的比例。免疫熒光檢測證實所得多邊形細胞表達角膜內皮分化標記物N型鈣粘素;經流式細胞儀分析，N鈣粘素陽性的細胞約占細胞總數的40％-5

20、0％，與鏡下觀察結果一致。RT-PCR結果證實多邊形細胞表達角膜內皮分化相關基因FoxC1和Pitx2。角膜內皮樣細胞動物移植術后手術組大鼠角膜逐漸恢復透明，水腫逐漸減輕，1個月后角膜可恢復正常透明度和厚度，而對照組大鼠角膜持續(xù)水腫混濁。激光共聚焦角膜顯微鏡觀察可見手術組大鼠角膜后彈力層被多邊形細胞覆蓋，細胞密度約為2872.6±172.7個/mm2，而對照組大鼠角膜后彈力層未見有細胞覆蓋。手術組大鼠角膜HE染色顯示其后彈力層有單細胞層

21、貼附，內皮面在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證實該單細胞層為角膜內皮樣細胞，術眼角膜內未見有異常新生物或炎細胞樣細胞浸潤，對照組大鼠角膜HE染色顯示其后彈力層面無細胞附著，熒光顯微鏡下無熒光信號。
　　 結論：利用條件培養(yǎng)基法可將大鼠神經嵴干細胞誘導分化為功能性角膜內皮樣細胞。
　　 第三部分：構建無上皮生物工程角膜及其動物移植的初步實驗研究
　　 目的：探討利用后板層APCM支架、角膜內皮樣細胞及角膜基質細胞構建無

22、上皮生物工程角膜的可行性及其動物移植效果評價。
　　 方法：1.同前法制備后板層APCM支架，利用條件培養(yǎng)基法誘導培養(yǎng)角膜內皮樣細胞。
　　 2.兔角膜基質細胞的原代培養(yǎng):取新鮮兔角膜，在解剖顯微鏡下撕去后彈力層，然后將角膜剪成小塊，用膠原酶消化后去除上皮層，將殘留基質碎塊貼壁培養(yǎng)，待基質細胞遷移出后移除基質塊，繼續(xù)培養(yǎng)遷移出的基質細胞，常規(guī)消化傳代。
　　 3.無上皮生物工程角膜的構建及兔穿透性角膜移植實驗:將

23、基質細胞制成細胞懸液，分別從8個方向將其用胰島素針注射入制備好的后板層APCM支架中，常規(guī)條件下培養(yǎng)并逐步增加角膜內皮樣細胞培養(yǎng)基的比例，逐步馴化基質細胞使其適應角膜內皮樣細胞培養(yǎng)環(huán)境，馴化完成后將角膜內皮樣細胞種植于后板層APCM支架的后彈力層面，常規(guī)培養(yǎng)2周后行兔穿透性角膜移植實驗，以后板層APCM空支架為對照，用羊膜覆蓋植片表面，術后每日典必殊眼水點眼4次，典必殊眼膏1次，裂隙燈定期觀察，并取材行病理檢查。
　　 結果：術

24、后1周術眼結膜充血，分泌物較多，羊膜溶解并自然脫落，生物工程角膜植片及APCM空支架植片水均明顯水腫，熒光素染色顯示生物工程角膜植片約70％區(qū)域的上皮已修復，而APCM空支架植片上皮修復緩慢且表面不光滑。術后2周炎癥反應略有減輕，生物工程角膜植片水腫有所消退，有溶解跡象，熒光素染色顯示植片上皮已基本修復，APCM空支架植片水腫程度較為嚴重，上皮層基本修復，但是表面欠光滑。角膜標本HE染色可見生物工程角膜植片基質內有大量炎細胞樣細胞，膠原