中慢生型天山根瘤菌luxI類AHL合成酶基因的鑒定、表達(dá)及對(duì)共生結(jié)瘤的影響.pdf

1、根瘤菌可以在豆科植物根部形成根瘤從而固氮空氣中的N<,2>，這其中包括了一系列不同的信號(hào)傳導(dǎo)過程。在許多根瘤茵中發(fā)現(xiàn)LuxR-LuxI類群體感應(yīng)是其中重要的調(diào)節(jié)因素之一，如調(diào)控結(jié)瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)生和固氮效率等。但目前對(duì)生長(zhǎng)速度介于快生和慢生之間的中慢生型屬根瘤菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)還沒有確切的報(bào)道。本文將中慢生型屬八個(gè)種的模式菌株培養(yǎng)至高細(xì)胞密度，對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行了乙酸乙酯的萃取抽提，應(yīng)用高效檢測(cè)菌株JZAl對(duì)其中的AHL分子

2、進(jìn)行了TLC分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中慢生型屬八種模式茵產(chǎn)生AHL信號(hào)分子的能力和類別有很大的差異性。其中可以在甘草等至少八種不同的豆科植物根部結(jié)瘤的中慢生型天山根瘤菌CCBAU 3306產(chǎn)生的AHL信號(hào)分子種類最多(八種)。對(duì)中慢生型天山根瘤菌進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，其培養(yǎng)上清中AHL的產(chǎn)生活性具有典型的依賴細(xì)胞密度的特征，即在低細(xì)胞濃度時(shí)產(chǎn)生較低的AHL活性，高細(xì)胞濃度時(shí)則產(chǎn)生較高的AHL活性。其后AHL活性降低則是由于在茵體生長(zhǎng)后期pH值升高而

3、導(dǎo)致了AHL分子的堿水解作用。 為了鑒定M.tianshanense中負(fù)責(zé)產(chǎn)生AHL分子的基因，在高拷貝質(zhì)粒pEZSeq-Kan中構(gòu)建了M.tianshanense的基因文庫并電轉(zhuǎn)化至E.coli中進(jìn)行表達(dá)。采用了一種簡(jiǎn)單新穎的篩選方法快速的從基因文庫細(xì)胞中篩選獲得了3株可以產(chǎn)生較高AHL活性的陽性克隆。對(duì)這3株陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析確定pHMZ9B1中含有的插入片斷最大，其測(cè)序結(jié)果表明，pHMZ9B1中的外源插入片斷中含有406lb

4、p堿基，該插入片斷中含有一個(gè)665bp的ORF和一個(gè)在其上游大小為819bp的ORF，經(jīng)balst分析，確定與其它幾種LuxI和LuxR型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有不同的同源性，因此分別被定名為MrtI和MrtR。為了驗(yàn)證在E.coli庫細(xì)胞中篩選鑒定得到的LuxI同源物MrtI在m．tianshanense中是否確實(shí)產(chǎn)生AHL信號(hào)分子，將mrtI側(cè)翼區(qū)進(jìn)行overlapping PCR并克隆至sacB自殺性質(zhì)粒載體pWM91中，與野生型菌株接

5、合后進(jìn)行同源基因的雙交換篩選獲得了mrtI完全突變?nèi)笔е?。?duì)mrtI突變株的培養(yǎng)上清進(jìn)行液體活性和TLC分析均未檢測(cè)到AHL活性。而MrtI/MrtR區(qū)域在E.coli中可以表達(dá)至少6種不同的AHL分子。同時(shí)對(duì)新的M.tian-shanense基因文庫進(jìn)行了重復(fù)的篩選均未發(fā)現(xiàn)不同于mrtI的自體誘導(dǎo)物合成酶基因，因此在M.tianshanense中MrtI負(fù)責(zé)了合成所有的AHLs分子。為了研究M.tianshanense中AHL合成酶基

6、因mrtI的表達(dá)情況，PCR擴(kuò)增mrtI基因的中間片斷并克隆至pVIK112中，與野生型菌株的mrtI，區(qū)域進(jìn)行同源交換后獲得了mrtI-lacZ融合表達(dá)菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該群體感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因mrtI呈自體誘導(dǎo)的方式，只有在具有很高AHLs活性的野生型菌株的上清存在的情況下mrtI才能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，而沒有AHL活性的mrtI突變株的上清并不能誘導(dǎo)mrtI的表達(dá)。與野生型菌株相比，M.tianshanense的mrtI群體感應(yīng)突變菌株在其宿