切口痛大鼠脊髓水平toll樣受體4及炎性細(xì)胞因子的變化.pdf

1、術(shù)后疼痛(postoperative pain)又稱急性傷害性疼痛,不同于一般的生理性疼痛,是手術(shù)后即刻發(fā)生的急性疼痛(通常持續(xù)時間不超過7d),是臨床最常見和最需緊急處理的急性疼痛。文獻(xiàn)報道75％以上的患者術(shù)后承受不同程度的疼痛,將導(dǎo)致機(jī)體病理生理的改變,產(chǎn)生一系列不良反應(yīng),如心率加快、心臟負(fù)荷增加、呼吸淺快、胃腸蠕動減慢、免疫功能下降等,嚴(yán)重影響患者術(shù)后的治療和生活質(zhì)量。目前,對術(shù)后疼痛的機(jī)制研究主要集中在外周和中樞敏化上,眾多研究

2、表明,炎癥因子與術(shù)后疼痛關(guān)系密切,如炎癥因子IL-1βIL-6、TNF-α等能引起中樞或外周敏化,在術(shù)后急性疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Toll樣受體4(Tolllike Receptor4,TLR4)是Toll樣受體家族重要成員之一,廣泛表達(dá)于各細(xì)胞系,在中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,是聯(lián)系天然免疫和后天免疫的橋梁。TLR4識別外源性配體如脂多糖(LPS)或內(nèi)源性配體如熱休克蛋白(HSP)后被激活,通過髓樣分化因

3、子88(Myeloid differentiation factorMyD88)依賴性途徑或MyD88非依賴性途徑,進(jìn)而介導(dǎo)炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的大量合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)。Tanga、Wadachi、Raghavendra等在神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛模型中研究發(fā)現(xiàn),位于脊髓膠質(zhì)細(xì)胞上的TLR4及下游細(xì)胞因子升高,其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在痛覺信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其在術(shù)后急性疼痛模型中的作用尚未見

4、報道。在手術(shù)創(chuàng)傷和應(yīng)激條件下,TLR4可識別內(nèi)源性損傷相關(guān)分子(DAMPs),如高遷移率簇蛋白1、熱休克蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)分解產(chǎn)物等內(nèi)源性配體,促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)無菌性炎癥反應(yīng),但圍術(shù)期這種無菌性免疫炎癥反應(yīng)是否參與了術(shù)后疼痛的形成與發(fā)展尚不清楚。在術(shù)后疼痛模型中,研究發(fā)現(xiàn)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞被激活,主要是由于傷害性信號沿初級傳入纖維至脊髓背角引起,在該神經(jīng)傳導(dǎo)通路中TLR4是否被激活并不清楚。本研究首次提出了TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參

5、與了術(shù)后疼痛的發(fā)生發(fā)展這一假設(shè)。
　　 目的：采用大鼠切口痛模型,觀察脊髓水平TLR4mRNA及炎性細(xì)胞因子IL-1βmRNA、TNF-amRNA表達(dá)的變化,探討TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在術(shù)后疼痛中的作用,從而為術(shù)后急性疼痛的治療尋找新靶點(diǎn)。
　　 方法：⑴健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠58只,體重180-220g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。⑵按照Brennan等提出的方法建立大鼠切口痛模型,吸入2%

6、異氟醚麻醉后,在大鼠左后爪從足底近端0.5 cm處向趾部作長約1cm縱行切口,深及皮下筋膜,然后用眼科鑷挑起足底肌肉并做縱向切割,但保持肌肉的起止及附著點(diǎn)的完整性,按壓止血后,用5-0尼龍線縫合皮膚兩針,手術(shù)切口處給予碘伏消毒并覆蓋抗生素軟膏,即完成模型制備。行為學(xué)檢測:分別在手術(shù)前0h、術(shù)后0.5h、1h、2h、8h、12h、1d、2d、3d、5d、7d應(yīng)用電子von Frey測定大鼠手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechani

7、cal withdrawal threshold,MWT)。⑶生化檢測:分別在手術(shù)前0h、術(shù)后2h、8h、1d、2d、3d、5d、7d各取6只大鼠取腰段脊髓(L4-6),采用熒光定量PCR(Real-Time PCR)方法檢測脊髓TLR4mRNA、IL-1βmRNA、TNF-amRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①切口痛大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的變化。所有大鼠術(shù)前左

8、右腳MWT基礎(chǔ)值無明顯差異,手術(shù)側(cè)(左腳)術(shù)后0.5h開始下降,在2h時下降最顯著,與術(shù)前和非手術(shù)側(cè)(右腳)MWT相比,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),術(shù)后7天MWT基本恢復(fù)到基礎(chǔ)值。非手術(shù)側(cè)在各時間點(diǎn)MWT均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。②切口痛大鼠脊髓水平TLR4mRNA的變化。術(shù)前大鼠脊髓中即有少量TLR4 mRNA表達(dá),手術(shù)刺激后8h(2.79±0.57)、1d(4.51±0.54)、2d(1.66±0.31)TLR4 mRNA

9、表達(dá)明顯上調(diào),與術(shù)前相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),在術(shù)后8h-1d表達(dá)較高,在術(shù)后1d達(dá)最高水平,而后逐漸減少,直到術(shù)后3d,與術(shù)前相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。③切口痛大鼠脊髓水平IL-1βmRNA的變化。IL-1βmRNA手術(shù)刺激后2h(2.33±0.61)開始升高,到術(shù)后8h(2.82±1.09)一直處于較高水平,與術(shù)前及術(shù)后各時間點(diǎn)相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),而后逐漸減少,在術(shù)后3d表達(dá)基本恢復(fù)到術(shù)前水平。④切

10、口痛大鼠脊髓水平TNF-αmRNA的變化。TNF-α在手術(shù)刺激后2h(1.96±0.41)開始升高,在術(shù)后2h、8h(4.48±1.24)、1d(2.40±0.40)、2d(1.75±0.40)與術(shù)前相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),在術(shù)后8h達(dá)最高水平,而后逐漸減少,直到術(shù)后3d,與術(shù)前相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑤TLR4mRNA與切口痛大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical withdrawalthreshold,MW

11、T)的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)r=-0.484,P＜0.05,兩者中度相關(guān)。⑥TLR4mRNA與IL-1mRNA變化關(guān)系的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)r=0.294,P＜0.05,兩者的變化情況呈低度相關(guān)。⑦TLR4mRNA與TNF-αmRNA變化關(guān)系的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)r=0.540,P＜0.05,兩者的變化情況呈低度相關(guān)。
　　 結(jié)論：⑴大鼠切口痛模型中,術(shù)后脊髓TLR4mRNA及炎性細(xì)胞因子IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表達(dá)升高。⑵TL