RegⅢ和胰島素原雙基因聯(lián)合干預1型糖尿病的作用及機制研究.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM),又稱胰島素依賴性糖尿病,是一種由自身反應性T淋巴細胞介導的以胰腺β細胞進行性損傷和胰島素分泌絕對不足為主要特征的自身免疫性疾病。在T1DM發(fā)病初期,活化的自身反應性T淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞大量浸潤胰島,其釋放出的炎性介質,如Th1型細胞因子和NO等發(fā)揮協(xié)同作用,引起胰腺β細胞凋亡、壞死以及胰島素分泌異常等,進而導致高血糖癥狀和其他T1DM并發(fā)癥的發(fā)生。目前常用

2、的1型糖尿病治療方法或多或少地均存在一定的不足,研究者們一直在致力于尋找更為安全有效的1型糖尿病治療方法。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,基因治療技術方興未艾,為1型糖尿病新型治療方法的研究開辟了一個嶄新的領域。
　　胰島素原是1型糖尿病發(fā)病過程中唯一的β細胞特異性、原發(fā)性自身抗原,在驅動自身免疫性β細胞損傷過程中發(fā)揮著重要的作用,它也是誘導免疫耐受的主要抗原。胰腺再生基因 Ⅲ(RegⅢ)是介導胰島β細胞再生的關鍵基因,它能夠刺激胰

3、腺導管上皮細胞轉化為β細胞,在促進胰島組織再生過程中起著重要的作用。
　　本研究選擇作用于1型糖尿病發(fā)病過程中兩個不同環(huán)節(jié)的關鍵靶點——胰島素原和RegⅢ基因,利用基因重組技術將其整合到含有雙啟動子的pBudCE4.1真核表達載體上,以構建含有 RegⅢ和胰島素原的雙基因質粒pReg/PI;并通過一系列體外實驗觀察pReg/PI質粒在真核細胞中的表達情況以及其對胰島β細胞株NIT-1細胞的作用;建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導的1型糖

4、尿病小鼠模型,肌肉注射給予pReg/PI質粒進行治療,觀察pReg/PI雙基因質粒對1型糖尿病小鼠的治療作用并初步探討其作用機制。
　　首先,利用RT-PCR技術從Balb/c小鼠基因組中調取胰島素原cDNA序列、雙酶切反應從pCMV-RegⅢ質粒中獲取RegⅢ cDNA序列,利用基因重組技術將RegⅢ cDNA和胰島素原cDNA分別插入空質粒載體pBudCE4.1所含的兩個啟動子下游的多克隆位點中,以構建pReg/PI雙基因質粒

5、。瓊脂糖凝膠電泳和基因測序結果表明,RegⅢ cDNA和胰島素原cDNA均成功插入pBudCE4.1質粒載體,插入方向正確,基因序列中未有點突變和讀碼框移發(fā)生,pReg/PI雙基因質粒構建成功。
　　其次,采用脂質體轉染法將pReg/PI質粒轉染cos-7細胞和NIT-1細胞,利用western blot技術檢測了RegⅢ蛋白和胰島素原在真核細胞中的表達情況,結果表明,pReg/PI質粒能夠在真核細胞中高效地表達胰島素原和RegⅢ

6、蛋白;通過流式細胞技術和MTT法研究了pReg/PI質粒轉染后對NIT-1細胞增殖、高糖或細胞毒性T細胞反應誘導的NIT-1細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)pReg/PI質粒轉染后能夠促進NIT-1細胞的增殖,抑制細胞毒性T淋巴細胞對NIT-1細胞的損傷反應,但是對高糖誘導的NIT-1細胞的凋亡并無明顯的改善作用。
　　最后,采用小劑量腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病動物模型,肌肉注射給予pReg/PI質粒治療5周,通過監(jiān)測小鼠血糖的變化來

7、觀察pReg/PI質粒改善1型糖尿病癥狀的作用。研究發(fā)現(xiàn)在造模初期給予pReg/PI質粒治療5周可明顯降低糖尿病小鼠的血糖并延緩1型糖尿病的發(fā)病時間。為了進一步探討pReg/PI質粒干預治療1型糖尿病的作用機制,對1型糖尿病小鼠的胰腺進行了病理組織學分析、采用Tunel法原位檢測了胰島中細胞的凋亡情況并利用western blot技術檢測了凋亡相關蛋白NF-κB和Bcl-2的表達情況、MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖反應、FACS法檢測了小

8、鼠體內CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的分化情況、酶聯(lián)免疫法分析了糖尿病小鼠血清中胰島素、細胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ和TGF-β)分泌的改變。結果表明,給予pReg/PI質粒進行治療能夠抑制糖尿病小鼠的脾淋巴細胞增殖反應、減少胰島淋巴細胞的浸潤并改善胰腺炎癥狀,通過減少促凋亡因子NF-κB的表達來抑制胰島細胞的凋亡、促進體內CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞分化和胰島素的分泌、恢復體內Th1/Th2反應