肝臟祖細胞-卵圓細胞在肝硬化及肝癌中的增殖、與肝臟微環(huán)境關系及部分生物學特性研究.pdf

1、第一部分：一、目的：證實肝硬化組織中存在人肝臟祖細胞(HPCs)，探討HPCs分布及激活的強度與肝臟炎癥程度的關系,提供HPCs向肝細胞分化的依據(jù)。
　　 方法：對30例肝硬化及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察，對門脈炎癥程度進行評分，并用膽管上皮標志CK7和肝星狀細胞激活標志SMA進行免疫組化染色，對符合HPCs、中間型肝細胞以及小管樣反應的細胞進行計數(shù)和半定量評分。
　　 結果：在正常肝組織中無門脈周圍HPCs和小

2、管樣反應增殖。在肝硬化組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)周圍向肝實質(zhì)擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖，其周圍有顯著的肝星狀細胞激活。HPCs及小管樣反應增殖程度隨著門脈炎癥程度的加重而增加。HPCs數(shù)目與中間型肝細胞數(shù)目之間存在正直線相關。ALT和AST與HPCs及中間型肝細胞數(shù)目存在正直線相關。
　　 結論：在人肝硬化中存在祖細胞的激活，炎癥反應是HPCs激活的觸發(fā)因素，H

3、PCs向肝實質(zhì)內(nèi)遷移并向肝細胞方向分化是肝再生的重要途徑。
　　 第一部分：二、目的：研究不同肝臟祖細胞標志物在人肝硬化組織中的定位和分布，明確肝臟祖細胞群的免疫表型特征。
　　 方法：用OV-6，CK7，CK19，Hepatocyte，c-kit以及AFP對30例肝硬化及3例正常肝組織進行免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光雙標，觀察這些標志物在不同細胞群中的分布。
　　 結果：正常肝臟中，膽管和膽小管上皮CK7及

4、CK19陽性，OV-6及c-kit陰性。在肝硬化中，門脈周圍區(qū)域的肝臟祖細胞(HPCs)及小管樣反應細胞主要為OV-6(+)/ CK19(+)/CK7(+)/ Hepatocyte(+)，少數(shù)為OV-6(-)。隨著門脈及實質(zhì)內(nèi)炎癥的加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)周圍向肝實質(zhì)擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖。HPCs及小管樣反應細胞主要為OV-6(-)/CK19(+)/CK7(+),Hepatocyte(-)或(+)；中間型肝細胞為OV

5、-6(-)/CK19(-)/CK7(+)/ Hepatocyte(+),少數(shù)Hepatocyte(-)。門脈周圍區(qū)域和纖維間隔內(nèi)存在少量的c-kit(+)細胞，個別陽性細胞整合到成熟膽管，其余c-kit(+)細胞不共表達OV-6、CK7及CK19。
　　 結論：人肝硬化存在肝臟祖細胞的激活；肝臟祖細胞群的免疫表型差異表明祖細胞處于不同的分化增殖階段；不同肝臟祖細胞標志物的聯(lián)合運用是鑒別和研究肝臟祖細胞的有力工具。
　　

6、第一部分：三、目的：研究肝臟祖細胞標志物c-kit、CK7在肝細胞肝癌(HCC)組織中的表達及其與臨床病理的關系。
　　 方法：對40例肝細胞肝癌標本及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察以及c-kit、CK7、CD45免疫組化染色，對腫瘤細胞的分化程度進行分型，分析c-kit、CK7表達與肝細胞肝癌的臨床病理特征的聯(lián)系。
　　 結果：正常肝臟中c-kit染色陰性。19/40例HCC組織中存在c-kit(+)腫瘤細胞，在腫

7、瘤細胞之間或腫瘤結節(jié)周圍分散分布。30例(75[％])存在CK7陽性癌細胞，陽性程度強弱不一，主要存在兩種不同免疫反應形態(tài)特征。HBsAg及Anti-HBc在c-kit(+)及CK7(+)HCC表達更常見(p<0.05)，c-kit、CK7表達與腫瘤的分化程度緊密相關(p<0.05)。
　　 結論：骨髓來源的肝臟祖細胞參與了HCC的形成和發(fā)展，c-kit、CK7對于判斷HCC預后有一定意義。
　　 第二部分：目的：闡明在

8、卵圓細胞介導的肝再生中肝臟非實質(zhì)細胞、胞外基質(zhì)成分與卵圓細胞的相互作用，分析肝臟微環(huán)境對卵圓細胞的調(diào)控作用。
　　 方法：采用免疫組化及免疫熒光雙標的方法動態(tài)觀察在2-AAF/PH大鼠卵圓細胞增殖模型中，隨著卵圓細胞的增殖和分化，Kupffer細胞、肝星狀細胞、肝臟胞外基質(zhì)成分(層粘連蛋白和纖維連接蛋白)的定位及與卵圓細胞的相互關系。
　　 結果：PH后第2天，小卵圓細胞開始向門靜脈周圍區(qū)域增殖。Desmin(+)的HS

9、Cs及l(fā)aminin主要出現(xiàn)在門靜脈周圍的肝竇狀隙內(nèi)，而Kupffer細胞和fibronectin在整個肝小葉內(nèi)表達顯著增加。從術后第4到第9天，卵圓細胞進一步向肝實質(zhì)內(nèi)增殖，與HSCs、laminin及fibronectin關系密切，Kupffer細胞與卵圓細胞混合在一起增殖，第6天以后開始減少。從術后第12到第15天，隨著卵圓細胞分化為小肝細胞節(jié)結，大多數(shù)HSCs、laminin及fibronectin位于節(jié)結周邊，少數(shù)出現(xiàn)在節(jié)結內(nèi)

10、，Kupffer細胞主要出現(xiàn)在中央靜脈周圍區(qū)域。第18天以后，正常的肝小葉結構開始恢復。
　　 結論：在肝損傷后的重建修復過程中，卵圓細胞與肝臟非實質(zhì)細胞、胞外基質(zhì)成分存在緊密的聯(lián)系，局部肝臟微環(huán)境可能通過細胞與細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的相互作用在卵圓細胞介導的肝再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 第三部分：目的：建立大鼠卵圓細胞增殖模型，探討其分離、鑒定、培養(yǎng)的方法；檢測卵圓細胞端粒酶活性及相關基因表達，探討與其增殖分

11、化之間的關系。
　　 方法：采用2-AAF/PH模型誘導大鼠卵圓細胞增殖，2-AAF劑量為15mg/kg，于術后9-12天采用改良的膠原酶灌注消化密度梯度離心法分離卵圓細胞，用電鏡、RT-PCR、細胞免疫熒光鑒定卵圓細胞，采用免疫組化、RT-PCR及端粒酶活性檢測試劑盒檢測分離的卵圓細胞及卵圓細胞系LE6端粒酶的表達，并分析其意義。
　　 結果：采用2-AAF/PH模型成功誘導大鼠卵圓細胞增殖。分離的卵圓細胞核大，卵圓形

12、，胞漿少，呈鋪路石樣生長，細胞直徑約7～12μm，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量絨毛樣突起，核漿比例大，胞漿內(nèi)細胞器少且發(fā)育不成熟。細胞免疫熒光、RT-PCR結果顯示表達0V-6、AFP、CK19、Albumin、C-KIT、CK18、Thy-1。免疫組織化學顯示端粒酶催化亞單位TERT表達在門靜脈周圍增殖的卵圓細胞細胞核內(nèi)，隨著卵圓細胞逐漸向肝細胞方向分化，TERT陽性細胞數(shù)目顯著較少。分離的卵圓細胞及卵圓細胞系均表達端粒酶亞單位TERT及TR，