RNAi阻抑急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1對(duì)共培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：急性白血病是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性疾病，大部分患者經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)化療后能獲得初始的的緩解，但即使進(jìn)行現(xiàn)代大劑量化療和造血干細(xì)胞移植，仍有相當(dāng)部分的病人難免最終復(fù)發(fā)。骨髓微小殘留病被認(rèn)為是復(fù)發(fā)的根源，而殘留的白血病細(xì)胞的生存離不開(kāi)骨髓造血微環(huán)境的支持，造血微環(huán)境異?？赡軈⑴c了微小殘留病的形成，因此改造骨髓造血微環(huán)境可能成為治療急性白血病的新策略?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor-1，SDF-1)主要由骨髓

2、基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。人SDF-1基因定位于10號(hào)染色體，根據(jù)其編碼氨基酸序列歸屬于趨化因子CXC亞家族，通過(guò)與造血干細(xì)胞和血液腫瘤細(xì)胞上其受體CXCR4結(jié)合，不僅在細(xì)胞的遷移和定位中發(fā)揮重要作用，而且影響瘤細(xì)胞的擴(kuò)增。有報(bào)道通過(guò)應(yīng)用受體阻斷劑能抑制瘤細(xì)胞生存，但抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1對(duì)急性白血病細(xì)胞有什么影響目前還不清楚。我們通過(guò)觀察RNA干擾抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1對(duì)共培養(yǎng)的急性

3、白血病Jurkat細(xì)胞的影響，探索通過(guò)改造骨髓造血微環(huán)境清除微小殘留病治療急性白血病的途徑。 方法：參照Dexter法分離培養(yǎng)完全緩解1年內(nèi)的急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中SDF-1含量，脂質(zhì)體介導(dǎo)SDF-1特異性RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性混合克隆(命名為SC1)，RT-PCR及ELISA法檢測(cè)RNA干擾后骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF-1mRNA和蛋白表達(dá)水平，以轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒骨髓基質(zhì)細(xì)胞(命名為S

4、C2)和未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(命名為SC3)作為對(duì)照。Jurkat細(xì)胞與急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，與轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒抑制SDF-1表達(dá)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(A組)，與未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞作為對(duì)照組(B組)。通過(guò)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、PCNA,Bcl-2,Bax,Fas,FasL的表達(dá)及藥物敏感性的變化，評(píng)估RNA干擾抑制SDF-1表達(dá)的作用。細(xì)

5、胞黏附和細(xì)胞增殖試驗(yàn)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)，細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、PCNA,Bcl-2,Bax,Fas,FasL的表達(dá)、藥物敏感性試驗(yàn)分別采用流式細(xì)胞術(shù)、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法、免疫細(xì)胞化學(xué)、MTT法檢測(cè)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下：1.急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，急性白血病完全緩解1年內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1含量為(2891±305)pg/ml，正常或無(wú)重大血液系統(tǒng)疾病

6、骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1含量為(1583±157)pg/ml，前者明顯高于后者(P＜0.05)，表明急性白血病完全緩解1年內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞仍過(guò)度表達(dá)SDF-1。 2.RNA干擾后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF-1mRNA和蛋白的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，SC1、SC2和SC3細(xì)胞SDF-1與內(nèi)對(duì)照β-actin光密度比值分別為0.20、1.46和1.48，ELISA結(jié)果顯示，SC1、SC2和SC3細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1蛋白含量

7、分別為(384±41)pg/ml、(2428±299)pg/ml和(2474±271)pg/ml，SC1細(xì)胞mRNA和蛋白水平明顯低于對(duì)照組，表明RNA干擾明顯抑制了SDF-1的表達(dá)。 3.抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF-1表達(dá)對(duì)共培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的影響3.1細(xì)胞黏附試驗(yàn)Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，先后計(jì)數(shù)懸浮的和總的Jurkat細(xì)胞，根據(jù)公式計(jì)算黏附率：(總細(xì)胞數(shù)-懸浮細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100％。A組

8、和B組細(xì)胞黏附率分別為28.8％±2.6％和57.4％±3.8％。抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1明顯降低Jurkat細(xì)胞黏附到骨髓基質(zhì)細(xì)胞層(P＜0.05)。 3.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，在0、24、48、72和96小時(shí)分別以臺(tái)盼蘭拒染法計(jì)數(shù)Jurkat活細(xì)胞數(shù)，按照Patterson公式Td=Tlg2/lg(Nt/NO)計(jì)算倍增時(shí)間。A組Jurkat細(xì)胞倍增時(shí)間為約42小時(shí)，B組為約29小

9、時(shí)，表明抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞增殖變緩。 3.3細(xì)胞周期Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3天，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，A組G0/G1、S和G2/M期Jurkat細(xì)胞比率分別為28.47％±2.39％、25.57％±1.90％和45.96％±3.24％，而B(niǎo)組分別為19.43％±2.80％、74.48％±3.23％和6.09％±1.96％。抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1使共培養(yǎng)

10、的Jurkat細(xì)胞G0/G1和G2/M期細(xì)胞增多，而S期細(xì)胞減少(P＜0.05)。 3.4細(xì)胞凋亡Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3天，TUNEL結(jié)果顯示A組Jurkat細(xì)胞陽(yáng)性率為15.2％±0.8％，而B(niǎo)組為5.4％±0.7％，抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞凋亡增多(P＜0.05)。 3.5PCNA,Bcl-2,Bax,Fas和FasL的表達(dá)Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)

11、3天，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示A組Jurkat細(xì)胞PCNA陽(yáng)性率為79.7％±2.6％，明顯低于B組的91.4％±2.9％(P＜0.05)。幾乎所有的Jurkat細(xì)胞表達(dá)Bcl-2、Bax、Fas和FasL，但兩組表達(dá)的陽(yáng)性程度不同，IamgeProPlus軟件分析后用總陽(yáng)性面積(μm2)×平均光密度/細(xì)胞數(shù)表示陽(yáng)性程度。A組Jurkat細(xì)胞Bcl-2、Bax、Fas和FasL的陽(yáng)性程度(×103/細(xì)胞)分別為82.5±6.0、166.3±

12、5.7、59.7±5.4和115.4±5.2，而B(niǎo)組分別為148.3±5.6、64.8±5.6、126.4±5.8和58.4±6.0。Bcl-2和Fas表達(dá)明顯減少而B(niǎo)ax和FasL明顯增多(P＜0.05)。 3.6藥物敏感性試驗(yàn)Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)1天再加入不同濃度(0，10，100，1000和10000nM)阿霉素共培養(yǎng)48小時(shí)，MTT法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞存活率并計(jì)算50％抑制濃度(IC50)，A組IC50

13、為585nmol/L明顯低于B組6162nmol/L。表明抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1使共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物敏感性增強(qiáng)。 結(jié)論：急性白血病完全緩解1年內(nèi)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1高于正常，利用RNA干擾的方法可阻抑骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1，抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SDF-1可使共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞黏附減少、增殖變緩、凋亡增多、對(duì)藥物阿霉素的敏感性增強(qiáng)。因此通過(guò)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)阻抑急性