阻抑骨髓基質SDF-1作用對HL-60細胞增殖、凋亡及藥物敏感性的影響.pdf

1、目的:髓內(nèi)殘留病變是急性白血病緩解后復發(fā)的根源.但是,來源于骨髓基質的信號如何影響髓內(nèi)殘留白血病細胞,其機制目前還不清楚.近年來研究發(fā)現(xiàn),基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)是骨髓基質細胞生成、分泌的一種重要的趨化因子,其唯一的受體CXCR<,4>是造血干細胞和白血病細胞表面有不同程度的表達,二者的結合在白血病細胞的移動、生存和凋亡以及造血干細胞動員和歸巢等方面發(fā)揮極其重要的作用

2、.因此,通過干預SDF-1/CXCR<,4>系統(tǒng)能否影響白血病細胞在骨髓內(nèi)的生存、增殖及凋亡,同時白血病骨髓內(nèi)白血病細胞對化療藥物的敏感性是否發(fā)生改變,如何變化等問題,目前國內(nèi)外尚缺乏系統(tǒng)性研究.該實驗通過研究SDF-1/CXCR<,4>系統(tǒng)與白血病細胞之間的關系,進一步認識微小殘留病變的形成機制,并為尋找通過改造白血病骨髓微環(huán)境逆轉細胞耐藥治療白血病的新的治療方法提供理論基礎.方法:該實驗中,收集13例正常及14例白血病骨髓標本,分離

3、骨髓單個核細胞,采用Dexter型貼壁細胞長期培養(yǎng)體系培養(yǎng)骨髓基質細胞,待基質細胞融合成層后,與急性髓細胞白血病細胞株HL-60細胞共培養(yǎng).該研究分成實驗組與對照組,對照組只加入等量培養(yǎng)液,實驗組加入10μg/ml抗CXCR<,4>的單克隆抗體12G5以阻斷SDF-1的生物學作用,12G5加入時間與共培養(yǎng)時間一致,在不同時相點檢測下述指標.(1)流式細胞儀檢測HL-60細胞膜表面CXCR<,4>的表達.(2)ELISA法檢測骨髓基質細胞

4、培養(yǎng)上清中SDF-1的含量.(3)倒置顯微鏡下觀察HL-60細胞在骨髓基質層上的粘附情況并計算粘附率.(4)臺盼藍排染法測定HL-60細胞的存活率并繪制細胞生長曲線.(5)流式細胞儀測定HL-60細胞增殖周期及凋亡率.(6)免疫組織化學染色檢測HL-60細胞原癌基因BCL-2、凋亡基因Fas及細胞增殖核抗原PCNA的表達.(7)培養(yǎng)體系中加入不同濃度化療藥物孵育,MTT染色,分光光度計測定不同時相點A<,540>值,繪制藥物殺傷效應曲線

5、,同時在形態(tài)學上觀察化療藥物Ara-C對HL-60細胞殺傷效應的變化.結論:(1)HL-60細胞表面中等程度表達CXCR<,4>,具有12G5作用的生物學基礎.(2)體外培養(yǎng)的骨髓基質細胞能分泌相當量的SDF-1,在白血病基質尤為顯著,提示SDF-1的高分泌參與形成白血病骨髓微環(huán)境的功能異常.(3)10μg/ml 12G5能有效阻抑骨髓基質細胞培養(yǎng)上清中SDF-1的活性.(4)白血病骨髓基質比正?；|具有更強的粘附HL-60細胞的作用.

6、(5)SDF-1活性受到抑制后,HL-60細胞的粘附率、活細胞率及PCNA表達下降,而且,進入靜止期的HL-60細胞比例增高,提示SDF-1活性受到抑制后白血病細胞增殖受抑.(6)SDF-1活性被抑制后,HL-60細胞凋亡率增加,Fas蛋白表達上調,Bcl-2蛋白表達下調,提示SDF-1活性抑制促進白血病細胞凋亡.(7)SDF-1活性受抑后,雖然Ara-C對HL-60細胞的早期殺傷作用減弱,但HL-60細胞耐藥出現(xiàn)延緩,化療藥物殺傷時間