第一部分 利用磁共振技術(shù)對移植到心臟內(nèi)的鐵磁性標記的骨髓間充質(zhì)干細胞進行在體示蹤的實驗研究;第二部分 冠狀動脈內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞移植后的存留、分布、遷移和心肌梗死后SDF-1的表達及細胞遷移機制.pdf

1、細胞移植是目前缺血性心臟病治療研究的熱點之一。目前大多動物實驗中對于細胞移植到體內(nèi)之后的存留、分化、遷移等的研究需要通過病理組織切片進行。本實驗的主要目的是尋找一種能夠?qū)σ浦布毎M行在體示蹤的手段，以能夠?qū)σ浦布毎隗w內(nèi)的存留、分布、遷移進行在體評價。 方法:實驗方法分為體內(nèi)和體外實驗兩部分，針對一種全新的細胞標記試劑對細胞的標記效率、對細胞的生長、分化、遷移的影響以及標記后的細胞直接心肌內(nèi)注射移植和經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植后的在體

2、顯影和在體顯影維持時間進行了研究。 體外實驗部分：從中華小型豬髂骨處抽取骨髓，體外培養(yǎng)擴增骨髓間充質(zhì)干細胞并進行鑒定。將鐵磁性造影劑和骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育培養(yǎng)36-48小時。使用普魯士藍染色標記后的細胞評價鐵離子標記的效率；使用MTT比色實驗評價標記對細胞生長能力的影響；使用臺盼藍染色檢驗標記后細胞的活性；用Costar TransWell24孔培養(yǎng)板進行細胞對化學(xué)因子的遷移實驗，評價細胞標記后的遷移能力是否受影響；使用細胞

3、分化誘導(dǎo)液評價細胞標記后的分化能力。 體內(nèi)實驗部分： 1．心肌內(nèi)直接注射移植:結(jié)扎冠狀動脈前降支建立豬的心肌梗死模型(n=15)，模型建立后10天將鐵離子標記的自體骨髓間質(zhì)細胞(1X10<'7>細胞/只動物)通過心肌內(nèi)直接注射方法移植到梗死或正常心肌組織內(nèi)，分別在細胞移植后當天、1周、2周、3周、4周進行常規(guī)心臟磁共振檢查，對移植細胞進行在體顯像。另外5只動物作為對照組，移植未標記的骨髓間質(zhì)細胞。分別在細胞移植后不同時間

4、取才動物心臟標本，切片進行普魯士藍染色觀察細胞在心肌內(nèi)的分布和形態(tài)。 2．經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植:在這部分實驗中我們采用豬的缺血再灌注模型進行研究，將冠狀動脈阻斷90分鐘后開放，通過導(dǎo)管將骨髓間充質(zhì)干細胞直接注射到梗死相關(guān)的冠狀動脈內(nèi)。實驗組6只，注射鐵離子標記的細胞，對照組3只注射未經(jīng)標記的骨髓間充質(zhì)干細胞。分別在細胞移植后當天、1周、3周進行磁共振檢查和病理組織取材。在組織取材時同時取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟組織進行切片，觀察細

5、胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植后在全身非靶器官的分布情況。 結(jié)果 體外實驗部分： 鐵離子轉(zhuǎn)染后，骨髓間質(zhì)細胞普魯士藍染色發(fā)現(xiàn)在細胞漿內(nèi)有藍色顆粒存在，細胞染色陽性率為95％以上；MTT實驗表明不同濃度的鐵磁性標記物對細胞增殖沒有明顯的影響；臺盼藍染色顯示標記后98％的細胞拒染臺盼藍；鐵磁性標記物對rhSDF-1和VEGF誘導(dǎo)的細胞遷移能力沒有影響；鐵離子標記后骨髓間充質(zhì)干細胞向成脂肪細胞、成骨細胞的分化能力不受影響。

6、 體內(nèi)實驗部分： 1．心肌內(nèi)直接注射：鐵離子標記的骨髓間充質(zhì)干細胞直接注射到心肌組織內(nèi)后，注射點均可通過磁共振顯像，表現(xiàn)為明顯的低信號灶影或信號缺失影像。動態(tài)觀察顯示細胞顯像可以持續(xù)到移植后4周，信號影呈動態(tài)變化，強度減低，范圍擴大。病理學(xué)檢查可以見移植細胞呈普魯士藍染色 陽性，并與磁共振影像學(xué)的顯影有很好的一致性。移植后早期細胞在心肌內(nèi)聚集成“島狀”，在移植后1周存活的細胞在心肌內(nèi)散在分布，并且按相同的方向排列。普魯士藍

7、染的顆粒均在存活的細胞胞漿內(nèi)，未見單獨存在的普魯士藍染色顆粒在梗死的心肌組織內(nèi)存在。對照組未發(fā)現(xiàn)注射點顯像和普魯士藍染色陽性細胞。 2．冠狀動脈內(nèi)注射：鐵離子標記的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射后，可在磁共振檢查中顯影，移植細胞在相關(guān)心肌組織區(qū)域內(nèi)呈散在的點狀分布，表現(xiàn)為低密度信號影像，大小不一。病理組織學(xué)檢查中可見胞漿藍染的細胞在左心室前壁、室間隔、右心室前壁的心肌組織內(nèi)分布，與磁共振檢查影像有良好的一致性。移植后當時細胞較

8、均勻的分布在心肌組織內(nèi)，1周后細胞散在分布。在移植1周后的肺臟、脾臟、腎臟內(nèi)均可見大量的細胞存在，肝臟組織內(nèi)少見移植細胞分布。結(jié)論：這種臨床應(yīng)用的超順磁性氧化鐵微顆粒磁共振造影劑，可以有效地標記骨髓間質(zhì)細胞，不影響細胞形態(tài)、生長、增殖、分化，不影響細胞對化學(xué)趨化因子的遷移能力。利用心臟磁共振技術(shù)可以對心肌內(nèi)注射的以及冠狀動脈內(nèi)注射的鐵離子標記的移植細胞進行在體示蹤。鐵離子標記方法結(jié)合磁共振技術(shù)為移植細胞的在體示蹤和觀察細胞的存留、遷移提