卵巢特異性轉(zhuǎn)錄因子NOBOX、NANOS3、LHX8在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、第一章轉(zhuǎn)錄因子NOBOX敲除小鼠新生卵巢芯片結(jié)果分析 目的：Nobox是生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有同源盒結(jié)構(gòu)域，Nobox基因敲除雌鼠表現(xiàn)為初級(jí)卵泡發(fā)育障礙，出生后14天卵巢被纖維組織填充，導(dǎo)致不孕。Nobox作為同源盒蛋白家族成員，通過(guò)DNA-同源盒結(jié)構(gòu)域相互作用調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在卵子早期發(fā)生過(guò)程發(fā)揮重要作用。研究目的是確定Nobox調(diào)控的下游基因，探討．Nobox對(duì)其他卵巢優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因在分子水平的調(diào)節(jié)。

2、 方法：通過(guò)基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分析Nobox基因敲除新生小鼠卵巢中基因的異常表達(dá)。 結(jié)果：基因芯片結(jié)果顯示，Nobox敲除新生小鼠卵巢組織中，29個(gè)卵子優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因表達(dá)水平較野生型降調(diào)≥5倍；5個(gè)卵子優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因表達(dá)量升高5倍以上。以O(shè)ct4、Rspo2、Nalp4c、Jagl、Sall4、Stra8、Dmrtl、Tekt2、1700019D03Rik和Lin28作為候選基因，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，

3、候選基因在兩種分析系統(tǒng)中表達(dá)變化趨勢(shì)一致。 結(jié)論：敲除Nobox基因會(huì)不同程度的改變卵巢特異性基因的表達(dá)，Nobox是調(diào)節(jié)卵子發(fā)生的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。通過(guò)對(duì)Nobox調(diào)控基因的研究將有助于我們充分認(rèn)識(shí)生殖系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控及卵子發(fā)生異常疾病的發(fā)病機(jī)制。 第二章NOBOX基因突變與卵巢早衰的相關(guān)性研究 目的：同源盒基因NOBOX在卵子中特異性表達(dá)，在卵泡早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用，是非綜合型卵巢早衰的候選基因之一。

4、本研究目的是探討NOBOX基因突變與卵巢早衰發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。 方法：以就診于Baylor College of Medicine的96名高加索卵巢早衰患者為研究對(duì)象，同時(shí)采集278例健康、卵巢功能正常的生育期女性外周血做為正常對(duì)照。利用直接測(cè)序法篩查卵巢早衰患者NOBOX基因突變情況，并利用凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)探討錯(cuò)義突變對(duì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合功能的影響。 結(jié)果：直接測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)已知的單核苷酸多態(tài)和4個(gè)新發(fā)突變。新發(fā)突變

5、包括2個(gè)單核苷酸多態(tài)、1同義突變和1個(gè)錯(cuò)義突變；其中p．Arg355His和p．Arg360Gln均發(fā)生在高度保守的同源盒結(jié)構(gòu)域內(nèi)。凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)證實(shí)p.Arg355His突變蛋白結(jié)合DNA的能力明顯降低，同時(shí)對(duì)野生型蛋白功能具有顯性負(fù)效應(yīng)。 結(jié)論：NOBX基因突變是一部分卵巢早衰患者的致病原因。 第三章 NANOS3、LHX8基因突變?cè)诼殉苍缢グl(fā)病機(jī)制中的作用 研究第一部分NANOS3基因突變與卵巢早衰的相關(guān)

6、性研究 目的：作為最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的母源性基因，Nanos3具有編碼RNA結(jié)合蛋白的功能，在生殖細(xì)胞向性象遷移分化的過(guò)程中起重要作用。Nanos3基因敲除小鼠表現(xiàn)為卵巢萎縮、各級(jí)卵泡缺乏及不孕。人NANOS3因在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，并與小鼠Nanos3具有高度同源性.提示NANOS3可能是卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的候選基因。本研究通過(guò)對(duì)168例POF患者進(jìn)行MANOS3基因突變篩查，

7、以探討NANOS3與POF病因的相關(guān)性。 方法：應(yīng)用變性高效液相色譜分析(denaturing high-performance liquidchromatography，DHPLC)(WAVE System 3500 Transgenomic Ltd，Omaha，NE)對(duì)80例中國(guó)漢族及88例美國(guó)高加索人種POF患者NANOS3基因的兩個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩查，對(duì)DHPLC圖形異常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物則直接行DNA測(cè)序分析(ABI P

8、RISM 310 AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City,CA)。 結(jié)果：結(jié)果顯示66例POF患者DHPLC圖形出現(xiàn)雙峰或?qū)ΨQ(chēng)性改變(漢族45例、高加索人種21例)，提示存在DNA序列變異。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)第一外顯子356位點(diǎn)發(fā)生堿基替換(c.356A>G)，檢索NCBI SNPs Database證實(shí)為已知同義單核苷酸多態(tài)(rs2016163)。其中雜合子、純合子在漢族及高加索人種POF組發(fā)

9、生頻率分別為42.5﹪、13.7﹪和14.8﹪、9.1﹪。NANOS3其他編碼序列區(qū)未發(fā)現(xiàn)致病突變。 結(jié)論：本研究沒(méi)有在中國(guó)漢族和美國(guó)高加索人種卵巢早衰患者中發(fā)現(xiàn)NANOS3致病突變，因此推測(cè)在中國(guó)漢族和美國(guó)高加索人群中NANOS3基因突變與卵巢早衰沒(méi)有明顯的關(guān)系。 第二部分 95例高加索卵巢早衰婦女LHX8突變分析研究 目的：LHX8(LIM homeobox 8)是一種在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具

10、有富含半胱氨酸一組氨酸的LIM結(jié)構(gòu)域，在哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)篩查L(zhǎng)HX8基因在95例高加索卵巢早衰患者中的突變情況，以探討LHX8在人類(lèi)卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中作用。 方法：以95名就診于Baylor college of medicine的美國(guó)高加索人種卵巢早衰患者為研究對(duì)象，同時(shí)收集94名卵巢功能正常的育齡期高加索女性外周血做為對(duì)照組，對(duì)L,HX8編碼序列進(jìn)行直接測(cè)序分析。 結(jié)果：在內(nèi)含子3和3’