心肌特異性miRNA在缺血后處理心肌保護(hù)機(jī)制中的作用.pdf

1、一.背景
　　 近年發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA,miRNA)在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類(lèi)非編碼的小分子單鏈RNA，其序列在物種間高度保守。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平特異性識(shí)別靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上相應(yīng)靶點(diǎn)，并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與之結(jié)合，從而抑制特定的靶基因而發(fā)揮作用。抑制方式取決于miRNA與靶點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合的程度，完全互補(bǔ)結(jié)合常導(dǎo)致靶基因降解，不完全互補(bǔ)結(jié)合則抑制靶蛋白翻譯。據(jù)推測(cè)，人類(lèi)大

2、約1/3基因可能受miRNA的調(diào)控，但目前只有少部分miRNA功能得到闡明。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)存在著組織特異性，如心肌特異性的miRNA有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-206、miRNA-199等。近幾年的研究表明，心肌特異性miRNA參與了心臟發(fā)育、細(xì)胞凋亡、心律失常、心肌肥厚及心力衰竭等多種心臟生理和病理過(guò)程，調(diào)控這些miRNA的表達(dá)可減輕甚至逆轉(zhuǎn)上述病理過(guò)程。
　　 缺血再灌注(I

3、schemic Reperfusion，IR)損傷機(jī)制及心肌保護(hù)的研究仍然是當(dāng)今熱門(mén)的課題。1986年，Murry等首次發(fā)現(xiàn)在離體狗的缺血再灌注模型中對(duì)缺血心肌進(jìn)行短暫的缺血再灌注處理，能在隨后的長(zhǎng)時(shí)間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預(yù)處理(Ischemic Preconditioning，IPC)，該效應(yīng)在多種動(dòng)物模型中得到證實(shí)。但由于臨床上無(wú)法預(yù)測(cè)何時(shí)發(fā)生缺血，所以其在臨床應(yīng)用中受到較大的限制。2003年VintenJohansen

4、實(shí)驗(yàn)室首次提出了缺血后處理(Ischemic Postconditioning, IPost)的概念。缺血后處理是在已缺血心肌的再灌注早期給予短暫、多次的缺血干預(yù)，其對(duì)心肌保護(hù)作用表現(xiàn)為梗死面積減小、加快心肌功能恢復(fù)、保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)及減少再灌注后心律失常的發(fā)生等。目前對(duì)缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究主要集中在其抑制心肌細(xì)胞凋亡的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。以往的報(bào)道顯示miRNA可能與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，而缺血后處理已經(jīng)被證明能夠減少

5、心肌細(xì)胞凋亡，我們推測(cè)miRNA有可能參與了缺血后處理心肌保護(hù)過(guò)程。
　　 二.目的
　　 本實(shí)驗(yàn)以大鼠在體心臟缺血后處理模型和心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型為研究對(duì)象，重點(diǎn)探討缺血再灌注損傷對(duì)心肌特異性miRNA表達(dá)的調(diào)控以及心肌特異性miRNA在缺血后處理心肌保護(hù)機(jī)制中可能發(fā)揮的作用，以期為臨床圍手術(shù)期的心肌保護(hù)提供新的理論和可能的治療方法。
　　 1.通過(guò)建立大鼠在體心臟缺血后處理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討缺血后處理?duì)整體心肌缺

6、血再灌注損傷的保護(hù)作用；
　　 2.研究缺血后處理對(duì)心肌特異性miRNA表達(dá)的影響，探討缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制；
　　 3.通過(guò)建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究心肌特異性miRNA對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 三.方法
　　 1.采用左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作大鼠在體心臟缺血后處理模型；將動(dòng)物隨機(jī)分為sham組(對(duì)照組)、IR組(缺血再灌注組)及IP組(缺血后處理組)。行左心室和

7、股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)、左室收縮峰壓(LVSP)、左室內(nèi)壓力變化最大速率(±dp/dtmax)以及再灌注后心律失常(室性心動(dòng)過(guò)速和心室纖維顫動(dòng))發(fā)生率。取靜脈血，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量；取大鼠心臟，分別采用TTC法測(cè)定心肌梗死體積；TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；在電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2.取心肌組織作基因芯片檢測(cè)，篩選出缺血再灌注組較對(duì)照組表達(dá)明顯改變

8、且心肌特異性表達(dá)的miRNA，并行RT-PCR驗(yàn)證，測(cè)定各組中這些心肌特異性miRNA的表達(dá)水平。
　　 3.用差速貼壁分離純化方法培養(yǎng)心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型；分別應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)表達(dá)有差異的miRNA-1和miRNA-133的模擬劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)；將培養(yǎng)細(xì)胞分為A組(缺血再灌注組)、B組(缺血再灌注+miRNA-1 mimic組)、C組(缺血再灌注+miRNA-1 inhibitor組)、D組(缺血再灌注+m

9、iRNA-133mimic組)和E組(缺血再灌注+miRNA-133 inhibitor組)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。
　　 四.結(jié)果
　　 1.在大鼠在體心臟缺血后處理模型中，與對(duì)照組相比，缺血再灌注組的HR(306±14次/分vs396±15次/分)、MAP(81.21±3.83mmHg vs101.38±4.26mmHg)、LVSP(103.04±4.40mmHg vs135.78±6.06mmHg

10、)、+dp/dtmax(3.31±0.19mmHg/svs5.78±0.34 mmHg/s)以及-dp/dtmax(2.82±0.13mmHg/s vs4.43±0.26 mmHg/s)均顯著下降(P＜0.05)；缺血后處理組中HR(337±16次/分)、MAP(89.44±4.70mmHg)、LVSP(113.65±5.72 mmHg)、+dp/dtmax(3.91±0.24 mmHg/s)以及-dp/dtmax(3.08±0.18

11、mmHg/s)較缺血再灌注組顯著增加(P＜0.05)；對(duì)照組未發(fā)生心律失常，與缺血再灌注組比較缺血后處理組VT(50％vs100％)及VF(12.5％vs75％)發(fā)生率均顯著降低(P＜0.05)；缺血后處理組血清中CK(120.00±6.58U/L)及LDH(50.15±2.65U/L)含量明顯低于缺血再灌注組(CK135.29±7.17U/L、LDH64.79±3.05U/L，P＜0.05)同時(shí)高于對(duì)照組(CK54.94±2.13U/

12、L、LDH34.15±1.22U/L，P＜0.05)；對(duì)照組未檢測(cè)到心肌梗死，缺血后處理組(13.40±0.95％)心肌梗死指數(shù)較缺血再灌注組(27.64±1.51％)明顯下降(P＜0.05)；缺血后處理組(20.81±1.23％)心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于缺血再灌注組(44.62±4.59％，P＜0.05)同時(shí)高于對(duì)照組(6.70±0.87％，P＜0.05)；電鏡觀察，較對(duì)照組缺血再灌注組心肌細(xì)胞有明顯破壞，缺血后處理后心肌破壞程度減輕。

13、提示缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷，而缺血后處理可以減輕缺血再灌注誘發(fā)的損傷。
　　 2.基因芯片篩選結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺血再灌注組中心肌特異性表達(dá)的miRNA-1(51964.34±1954.28 vs24454.18±987.64)和miRNA-133(4705.42±223.85 vs2362.14±1013.29)的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P＜0.05)，提示缺血再灌注損傷有可能與心肌特異性的miRNA-1和miRNA-1

14、33的表達(dá)水平降低有關(guān)；進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，與缺血再灌注組相比，缺血后處理組中miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)量分別升高了1.415倍和1.463倍，提示缺血后處理可相對(duì)增加miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)量，并可能與凋亡的減少有關(guān)。
　　 3.在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，與A組(17.34±1.19％)相比，B組(13.25±0.90％)和D組(12.40±0.82％)心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低(

15、P＜0.05)，提示應(yīng)用miRNA-1和miRNA-133模擬劑可以部分抑制缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡；C組(20.71±1.48％)和E組(20.87±1.66％)心肌細(xì)胞凋亡率均顯著增高(P＜0.05)，提示應(yīng)用miRNA-1和miRNA-133抑制劑可能會(huì)進(jìn)一步加重缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 五.結(jié)論
　　 1.心肌缺血再灌注可抑制心肌特異性的miRNA-1和miRNA-133表達(dá)并可導(dǎo)致心肌細(xì)胞