紫外線影響晶狀體上皮細胞縫隙連接通訊的研究.pdf

1、目的：長期慢性的紫外線輻射(Ultraviolet Radiation)被認為是老年性白內障形成的主要原因。有關紫外線輻射導致白內障的機制還不太清楚,國內外大量學者已從紫外線對晶狀體蛋白的氧化損傷及DNA的直接損傷方面探討了紫外線與白內障形成的關系。最近的研究表明,晶狀體在無氧條件下受紫外線輻射也會出現(xiàn)離子平衡紊亂。因此,有人認為紫外線對調控細胞間離子平衡的膜通道也具有損傷作用?？p隙連接(Gap Junction)介導的細胞間通訊(Ga

2、p Junction IntercellularCommunication,GJIC)是細胞間主要通訊方式,GJIC允許小分子自由通過,調控細胞間離子平衡。晶狀體上皮細胞間GJ是相鄰的晶狀體上皮細胞間縫隙連接蛋白(Connexin43,CX43)組成的。那么,UVA是否會對Connexin43產生某種方式的損傷作用呢?本研究依據(jù)以上推測,探討Connexin43是否是uVA對晶狀體損傷的潛在靶點,同時觀察UVA對晶狀體上皮細胞的這種損傷

3、作用是否是可逆的,進一步分析這種損傷作用會有哪些細胞內傳導通路的參與。
　　 材料與方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)、UVA照射及測定細胞存活率細胞選取人晶狀體上皮細胞SRAO1/04,培養(yǎng)于DMEM。UVA照射強度分別為0、5、10、20、40 J/cm2。細胞生存率由CCK-8試劑盒測定,OD450值為不可逆細胞凋亡比例。并且根據(jù)不同照射強度下晶狀體上皮細胞存活率,選擇UVA的最適實驗強度。
　　 2、測定CX43

4、 mRNA和蛋白含量以及SLDT實驗實驗分組是按UVA照射和空白對照分為兩組。同時UVA停止照射后,會有不同觀察時間點,我們選取停止照射后的0、1、2、4、8、16小時。SRA01/04細胞經10 J/cm2 UVA照射后,按照預先設定的不同時間點,分別提取細胞總RNA,逆轉錄為cDNA,定量real-time PCR測定細胞內CX43的mRNA含量以及停止照射后mRNA的變化趨勢。SRA01/04細胞經超聲裂解后,蛋白轉移至PVDF膜

5、,加入CX43抗體,運甩Western-blot方法測定CX43蛋白含量以及停止照射后的蛋白變化趨勢。SLDT實驗是為了測定GJIC活性。SRA01/04細胞經UVA照射后,分別加入熒光素黃(Kuciferyellow,LY)和羅丹明(Rhodamine-dextran,RD)。細胞經手術刀劃痕后,分別在上述時間點由多聚甲醛固定,觀察LY和RD的擴散速度,經熒光顯微鏡數(shù)字成像系統(tǒng)照像。
　　 3、測定細胞內活性氧、脂質過氧化程度

6、以及PKC活性SRA01/04細胞經UVA照射后,在上述時間點,運用流式技術測定細胞內活性氧(ROS)的含量及變化趨勢,運用MDA檢測細胞脂質過氧化程度及變化趨勢。同樣的,PKC的活性也經由上述干預因素處理后,運用PKC活性檢測系統(tǒng)Genmed,檢測PKC活性及變化趨勢。
　　 4、統(tǒng)計學方法選擇實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差表示。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和t檢驗,P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：

7、r>　　 1、不同強度的UVA對SRA01/04存活率的影響晶狀體上皮細胞SRA01/04在不同強度的UVA照射后,會出現(xiàn)細胞存活率的改變。細胞存活率由CCK-8檢測。當UVA照射強度為5 J/cm2時,細胞存活率約為80％。隨著UVA照射強度的增加,細胞存活率降低。當UVA照射強度為40 J/cm2時,細胞存活率下降至20％左右。我們發(fā)現(xiàn),當UVA照射強度為10 J/cm2時,細胞生存率約為46％。因此,我們把10 J/cm2作為U

8、VA的最適照射強度,用于后續(xù)實驗。
　　 2、UVA對CX43的mRNA和蛋白表達的影響以及SLDT實驗CX43的mRNA由定量real-time PCR測定。SRA01/04經10 J/cm2UVA照射后,CX43的mRNA明顯比對照組降低。停止照射1小時后,CX43的mRNA水平開始緩慢升高,并在隨后的2至8小時持續(xù)升高。停止照射后的16小時,SRA01/04細胞CX43的mRNA水平恢復至照射前的基線水平。同樣的,CX43

9、的蛋白也有上述變化。SRA01/04經10 J/cm2UVA照射后,CX43蛋白明顯下降。停止照射后1小時,CX43蛋白開始緩慢升高,并在隨后的2至8小時持續(xù)升高。停止照射后的16小時,SRA01/04細胞CX43的蛋白水平恢復至照射前的基線水平。這種變化說明10 J/cm2 UVA照射對細胞CX43的影響是在mRNA和蛋白兩個水平,而且這種變化是可逆的。檢測CX43功能的劃痕實驗,即SLDT實驗也出現(xiàn)了上述同樣的變化。SRA01/04

10、經10 J/cm2 UVA照射后,可見實驗組LY僅在劃痕處的兩側小范圍內,而對照組LY范圍較大,約擴散五至六層細胞。停止照射后,實驗組LY開始逐漸擴散,約16小時后,兩組間無明顯差別。RD因無法經CX43擴散至細胞內,兩組均觀察到RD停留在劃痕處的兩側小范圍內,兩組間始終無差別。
　　 3、UVA對ROS、脂質過氧化、PKC的影響我們運用流式技術檢測晶狀體上皮細胞SRA01/04經UVA照射后的胞內ROS變化。我們發(fā)現(xiàn)UVA照射

11、可導致胞內ROS的急速上升,說明細胞內氧壓力的增加。在隨后的16小時內,ROS開始下降,提示胞內應激狀態(tài)有所恢復。同樣的,我們運用MDA檢測胞內脂質過氧化程度。UVA照射后,我們檢測到超過80％的MDA的升高。停止照射后的1小時和2小時,約分別有60％和40％的升高。在停止照射的16小時,脂質過氧化狀態(tài)得以大部分的恢復。PKC活性在LWA照射后也存在上述變化,UVA照射后,PKC活性約有58％的升高,在隨后的16小時內,PKC活性逐漸降

12、低。說明LWA引起的PKC活性的變化是可逆的。
　　 結論：
　　 1、經不同強度的UVA照射,可導致晶狀體上皮細胞SRA01/04存活率的變化。5 J/cm2至40 J/cm2的照射強度可導到SRA01/04存活率的變化范圍為80％至20％。10J/cm2的UVA照射后,SRA01/04存活率約為46％。我們把10 J/cm2作為后續(xù)實驗的最適照射強度。
　　 2、UVA照射可導致CX43的mRNA和蛋白兩個水

13、平的下降,但是,這種變化是可逆的。UVA照射可導致CX43功能狀態(tài)的變化,SLDT實驗中,LY的擴散速率是暫時的,可逆的。說明UVA導致的CX43的功能變化是可逆的。
　　 3、UVA照射可導致SRA01/04細胞內ROS和脂質過氧化的增加,說明UVA照射可以引起氧壓力的變化。細胞內信號轉導通路如PKC也參與了UVA照射的細胞內應激反應。更重要的是,以上指標,ROS、脂質過氧化程度和PKC活性在UVA停止照射后,逐漸復原。說明U