胃癌miRNA表達譜的鑒定及miR-374b-5p的功能研究.pdf

1、目的:
　　通過鑒定與人胃癌密切相關的microRNAs(miRNAs)表達譜，初步篩選出在人胃癌細胞株中高表達的miRNAs；探討miR-374b-5p、RECK與胃癌侵襲轉移生長的關系，進一步闡明miR-374b-5p在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)人胃癌細胞株 SGC-7901、MGC-803、NCI-N87和正常胃黏膜上皮細胞GES-1，分別提取總RNA進行miRNA芯片分析；qRT

2、-PCR技術驗證部分差異表達的miRNA。
　　2.通過生物信息網絡平臺預測目的miRNA的作用靶點。設計合成has-miR-374b-5p ASODA，將其轉染于人胃癌細胞株MGC-803，以空載體和無關寡核苷酸序列為對照。qRT-PCR檢測轉染效率；CCK-8法觀察胃癌細胞轉染后的生長情況；Trans-well小室法和劃痕試驗觀察胃癌細胞轉染后的侵襲和遷移影響；qRT-PCR驗證RECK表達變化；Western Blot法驗證

3、RECK蛋白表達。
　　結果:
　　1.微陣列芯片可見，相對正常胃粘膜細胞GES-1，共有115個miRNAs在胃癌細胞株中存在兩倍及以上差異表達；其中在NCI-N87細胞中27個miRNAs表達上調、25個miRNAs表達下調，在SGC-7901細胞中21個miRNAs表達上調、8個miRNAs表達下調，在 MGC-803細胞中19個miRNAs表達上調、15個miRNAs表達下調。選取MGC-803細胞中上調表達的miR

4、-374b-5p、miR-182-5p、miR-15-5p進行qRT-PCR驗證，證明芯片結果基本可信。miR-374b-5p在MGC-803細胞中明顯高表達。
　　2.通過生物信息學分析發(fā)現，RECK可能為miR-374b-5p的靶基因。MGC-803細胞以Lipofectamin2000為轉染試劑時，其轉染效率在80％左右。轉染miR-374b-5p抑制劑后，胃癌細胞miR-374b-5p表達顯著降低。轉染后miR-374b-

5、5p抑制組較對照組的抑制率明顯增高。轉染hsa-miR-374b-5p抑制劑后細胞侵襲和遷移的能力均下降。qRT-PCR發(fā)現轉染組較對照組RECK的mRNA明顯上升；Western Blot法檢測發(fā)現轉染組RECK蛋白表達上升。
　　結論:
　　1.初步篩選出109個與人胃癌相關miRNAs。
　　2.miR-374b-5p可能在人胃癌中高表達。
　　3.miR-374b-5p可能通過RECK通路調控胃癌侵襲轉移