腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)腎衰貧血大鼠及促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的影響.pdf

1、慢性腎衰竭(chronicrenalfailure，CRF)是多種慢性腎臟疾病的最終結(jié)果，多并發(fā)腎性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松等癥。貧血被認(rèn)為是CRF的一個(gè)標(biāo)志。當(dāng)CRF患者腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)低于30ml/min時(shí)，必然出現(xiàn)貧血，貧血是CRF最常見(jiàn)癥狀之一。CRF并發(fā)貧血使患者生存率降低，增加心血管事件等重要臟器嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。最近有研究表明對(duì)CRF貧血早期進(jìn)行干預(yù)性治療，可減輕左心室肥厚，改善貧血對(duì)重要臟

2、器的損害，有可能改善腎功能，提高患者生活質(zhì)量，因此糾正早期腎性貧血具有十分重要意義。本實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)部分研究了腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)腎性貧血的治療作用。第一部分檢測(cè)治療前后大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、血紅蛋白(Hb)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)的水平，測(cè)定紅細(xì)胞脆性、大鼠紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量，比較腎性貧血大鼠的腎臟病理形態(tài)，研究腎衰養(yǎng)真膠囊改善腎性貧血大鼠貧血狀態(tài)的機(jī)理。第二部分應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT

3、-PCR)檢測(cè)大鼠髓質(zhì)EPO基因的表達(dá)水平，觀察腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)EPO基因表達(dá)的影響。第一章腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)腎衰貧血的改善作用 目的：探討中藥腎衰養(yǎng)真膠囊改善腎衰貧血大鼠的機(jī)理。觀察大鼠BUN、SCr、血清鐵、Hb、TF、EPO水平的變化，測(cè)定紅細(xì)胞脆性、大鼠紅細(xì)胞內(nèi)GSH含量，比較腎性貧血大鼠的腎臟病理形態(tài)。 方法：1.購(gòu)入80只SD雄性大鼠，三天后，預(yù)留10只為正常組，70只參照文獻(xiàn)采用二步法5/6腎切除制作慢性腎衰貧血

4、模型。腹腔注射10％水合氯醛麻醉，皮膚消毒后切開(kāi)大鼠右腹壁，暴露右腎，切開(kāi)上、下兩極的包膜，呈放射狀切除右腎上、下兩極，切除約70％，迅速用明膠海綿輕壓在殘留腎的創(chuàng)面后，依次縫合關(guān)腹。10天后經(jīng)左腹壁暴露左腎，血管鉗夾住血管，結(jié)扎，摘除左腎。六周后斷尾取血，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清BUN、Scr和TF，堿化血紅蛋白法測(cè)血紅蛋白，留取血清待測(cè)血清鐵、EPO含量。符合模型條件的大鼠隨機(jī)分為五組，即空白對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、

5、益血生組。正常組不施加任何影響，空白對(duì)照組予蒸餾水灌胃，益血生組予益血生膠囊3g/kg灌胃，高、中、低劑量組大鼠分別給予腎衰養(yǎng)真膠囊16g/kg、8g/kg、4g/kg(生藥含量)灌胃一個(gè)月。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由進(jìn)水。治療結(jié)束后，腹主動(dòng)脈采血，預(yù)留2ml以肝素抗凝，其余分離血清，測(cè)定BUN、血Scr、TF、血清鐵、EPO含量。 2.血生化檢測(cè)：采用OlimpasAU600自動(dòng)生化分析儀測(cè)BUN、SCr、TF。

6、 3.一般指標(biāo)檢測(cè)：血紅蛋白應(yīng)用堿化血紅蛋白比色法檢測(cè)，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度換算結(jié)果；全血GSH檢測(cè)采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度換算結(jié)果；血清鐵測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度換算結(jié)果；血清EPO含量檢測(cè)采用酶鏈免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法(購(gòu)自美國(guó)TPI公司)。 4.紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)取抗凝血滴入不同濃度的氯化鈉溶液(2.4g/L，2.8g

7、/L，3.2g/L，3.6g/L，4.0g/L，4.4g/L，4.8g/L，5.2g/L，5.6g/L，6.0g/L)，每管一滴，搖勻后靜置4℃冰箱兩個(gè)小時(shí)，觀察結(jié)果。 5.大鼠腎組織病理學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)?zāi)┙馄蚀笫?，每組選兩只留取殘余腎組織放置10％福爾馬林液中固定，行過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色。 結(jié)果：1.給藥前后血紅蛋白變化：給藥前模型各組之間血紅蛋白水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。

8、給藥后腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量組血紅蛋白值高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，高、中劑量組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。低劑量組、益血生組高于對(duì)照組(P＜0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量改善貧血作用優(yōu)于益血生。 2.給藥前后血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白變化：給藥前模型各組之間血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。給藥后治療各組血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白值高于對(duì)照組(P＜0.05)，高、中劑量組

9、和益血生組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但明顯高于低劑量組(P＜0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量和益血生有促進(jìn)鐵吸收、利用的作用。 3.各組間紅細(xì)胞脆性比較：正常組脆性小于低劑量組和對(duì)照組(P＜0.05)，治療組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，低劑量組脆性小于對(duì)照組。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量、益血生有降低紅細(xì)胞脆性的作用。 4.各組間血液中GSH含量比較：各組GSH含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。高、中劑量組

10、血液中GSH含量高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，正常組、高、中劑量組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊高、中劑量提高血液中GSH含量的作用優(yōu)于益血生。 5.給藥前后血清EPO水平比較：給藥前模型各組之間EPO水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。給藥后，各組血清EPO水平仍顯著低于正常組(P＜0.01)，但高、中劑量組EPO水平明顯升高，與給藥前有顯著性差異(P＜0.01)

11、，低劑量組略升高(P＜0.05)，益血生組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高、中劑量組EPO水平高于低劑量組、益血生組(P＜0.05)，高、中劑量組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。低劑量組、益血生組顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。表明腎衰養(yǎng)真膠囊提高血液中EPO含量的作用優(yōu)于益血生。 6.大鼠腎組織病理結(jié)果比較：模型組大鼠腎小球囊腔及腎小管可見(jiàn)大量蛋白，腎小球血管硬化，纖維化，玻璃樣變，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣變；腎衰養(yǎng)真膠囊高、低劑量組可見(jiàn)腎小

12、球囊腔及腎小管大量蛋白，系模增生，纖維化，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣變，中劑量組腎小球囊腔及腎小管未見(jiàn)蛋白，可見(jiàn)系模增生。益血生組腎小球囊腔可見(jiàn)蛋白，系模增生，纖維化，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)論：1.腎衰養(yǎng)真膠囊和益血生膠囊均可改善腎性貧血，腎衰養(yǎng)真膠囊療效優(yōu)于益血生膠囊，腎衰養(yǎng)真膠囊中劑量組療效為佳。腎衰養(yǎng)真膠囊能提高血清中EPO水平，貧血狀態(tài)改善，病理圖片顯示治療組與對(duì)照組相比，大鼠腎小球囊腔及腎小管蛋白顯著減少，腎小球血管硬

13、化、纖維化、玻璃樣變和近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣變等損害明顯減輕，表明腎衰養(yǎng)真膠囊具有保護(hù)腎小管及管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)合成分泌EPO的作用。 2.腎衰養(yǎng)真膠囊能降低腎性貧血大鼠的紅細(xì)胞溶血的液體濃度，說(shuō)明腎衰養(yǎng)真膠囊能夠增加紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低紅細(xì)胞脆性，從而延長(zhǎng)紅細(xì)胞的壽命。 3.腎衰養(yǎng)真膠囊能顯著提高大鼠紅細(xì)胞內(nèi)GSH水平，療效優(yōu)于益血生膠囊。說(shuō)明腎衰養(yǎng)真膠囊通過(guò)提高體內(nèi)GSH濃度，增加抗氧化系統(tǒng)活性

14、，降低過(guò)氧化物毒性，保護(hù)紅細(xì)胞免受損傷，達(dá)到改善腎衰貧血的目的。 4.腎衰養(yǎng)真膠囊能顯著提高CRF貧血大鼠的血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，說(shuō)明腎衰養(yǎng)真膠囊可以促進(jìn)鐵劑的吸收，提高鐵的利用。 第二章腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)腎衰貧血大鼠EPO基因表達(dá)的影響 目的：觀察腎衰貧血大鼠EPO基因表達(dá)的變化，探討腎衰養(yǎng)真膠囊對(duì)腎衰貧血大鼠EPO基因表達(dá)的影響。 方法：1.動(dòng)物標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)?zāi)┙馄蚀笫蠛?，?jīng)4℃預(yù)冷焦碳酸二乙酯(DEPC

15、)水反復(fù)灌洗腎臟，修剪留取腎髓質(zhì)200mg，RNAin液保存于-20℃冰箱中待測(cè)。 2.半定量RT-PCR檢測(cè)EPO基因的表達(dá)：取新鮮凍存腎組織200mg，按Trizol使用說(shuō)明，提取總RNA，測(cè)定其純度和含量。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物序列，EPO：引物1序列為5'-AGGCGCGGAGATGGGGGTGC-3′，引物2序列為5'-CCCCGGAGGAAGTTGGAGTAG-3'；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)：引物1序列為5'-GTG

16、GGGCGCCCCAGGCACCA-3'，引物2序列為5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，并經(jīng)聯(lián)網(wǎng)檢索geneBank，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成引物序列。取總RNA2μg，用一步法RT-PCR試劑盒獲取目的片段。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增條件：逆轉(zhuǎn)錄30min，預(yù)變15min，然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。EPO擴(kuò)增產(chǎn)物540bp，β-actin

17、擴(kuò)增產(chǎn)物500bp。最后擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠(EB)染色，于紫外燈下拍照，將膠片上反應(yīng)帶在GelDoc1000凝膠成像分析系統(tǒng)中掃描、打印并分析電泳帶的灰度，將EPO擴(kuò)增產(chǎn)物和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值進(jìn)行比較。 結(jié)果：各組大鼠RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，Marker標(biāo)記片斷為540bp和500bp，符合目的基因長(zhǎng)度(圖2-1)。各組間灰度比較，高、中劑量組表達(dá)量明顯高于正常組(P＜0.01)，低