醫(yī)用臭氧的脊髓過氧化損傷作用及免疫調(diào)節(jié)的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 近年，醫(yī)用臭氧(ozone，O3)注射技術(shù)在疼痛臨床中均顯示了良好的應用前景。臭氧是氧分子的同素異形體，具有極強的氧化分解殺菌消毒能力。臭氧依靠與生物大分子反應生成的活性氧(ROS)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(LOPs)產(chǎn)生治療作用，但ROS和LOPs一旦超出機體的抗氧化能力，則會導致機體的過氧化損傷。目前臭氧治療的濃度及劑量國內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的標準。相關(guān)研究將不同濃度(30，50，80μg/ml)的醫(yī)用臭氧經(jīng)小腦延髓池

2、注入兔蛛網(wǎng)膜下腔，結(jié)果表明鞘內(nèi)注射較高濃度（50，80μg/ml）醫(yī)用臭氧對脊髓造成過氧化損傷作用，且損傷程度與臭氧濃度有量效關(guān)系;同時在較高濃度(40，60μg/ml)臭氧作用下星形膠質(zhì)細胞細胞形態(tài)明顯受損，細胞膜通透性增加，表現(xiàn)在乳酸脫氫酶(LDH)漏出率增加、細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平升高。
　　 過氧化損傷是多因素、多環(huán)節(jié)的級聯(lián)過程，而細胞凋亡是導致神經(jīng)細胞過氧化損傷的主要機制之一。凋亡是多基因嚴格控制的過

3、程。凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2及二者的比例對細胞的生存和死亡具有重要的調(diào)控作用。脊髓損傷后，電鏡下可觀察到枕葉皮質(zhì)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹呈空泡樣，脊髓呈現(xiàn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)性損傷及Bcl-2，Bax的表達變化。細胞凋亡具有獨特而復雜的信號系統(tǒng)，其發(fā)生過程的啟動和進行受到精確調(diào)控，其中JNK/MAPK通路可被炎癥、應激和損傷啟動的信號激活并介導細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導，激活的JNK通路可調(diào)控凋亡相關(guān)基因家族成員的差異性表達:如Bax的表達上調(diào)和Bc

4、l-2的表達下調(diào)。
　　 機體在受到外界傷害性刺激時，會自發(fā)進行保護性免疫應答。氧化應激所激活的脂質(zhì)過氧化反應可進一步活化機體免疫反應的發(fā)生。Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)在針對病原體入侵的防守中發(fā)揮重要作用，能夠特異性識別病原相關(guān)的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，不僅可以激活固有免疫，而且可以調(diào)節(jié)獲得性免疫。作為脂多糖LPS

5、（lipopolysaccharide）的主要識別受體，Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)可進一步識別LPS激活靶細胞誘導產(chǎn)生的炎性因子（如TNF-α、IL-6等）。TLRs的適當激活有利于機體抵抗過氧化損傷，過度激活所引起的持續(xù)性免疫反應也會給機體帶來不利影響，在LPS持續(xù)刺激下TLR4可介導敗血病和感染性休克的發(fā)生，因此TLRs的激活必須受到嚴密的負向調(diào)控，以保持機體免疫的相對穩(wěn)定。
　　

6、泛素化過程是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications，PTM)的一種形式，調(diào)節(jié)多種細胞生物學過程。泛素化作用是細胞內(nèi)存在的負向調(diào)控因子抑制或終止信號蛋白表達的主要機制之一。泛素化經(jīng)泛素標記后的蛋白質(zhì)經(jīng)特異性識別后降解，在細胞的抗原呈遞及炎癥反應等占有重要地位，其中泛素連接酶E3(ubiquitin-protein ligase E3)在泛素化修飾中具有中心作用。有研究表明，WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋

7、白連接酶1 WWP1(WW domain containing E3 ubiquitinprotein ligase1)可能參與機體炎癥反應的過程，炎性因子TNF-α可誘導WWP1的產(chǎn)生。同時，LPS-TLR4介導的炎性反應能夠誘導機體的固有免疫反應，而WWP1通過拮抗DAF-2胰島素信號轉(zhuǎn)導通路進而調(diào)節(jié)機體的固有免疫。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β（transforming growth factorβ）可誘導WWP1的表達水平升高，可能與W

8、WP1抑制TGF-β的負反饋調(diào)節(jié)作用有關(guān);而TGF-β所介導的抗炎反與LPS-TLR4所介導的炎性反應之間的平衡在機體許多炎性疾病中發(fā)揮了重要作用。經(jīng)研究證實TLR4受體的表達受TGF-β的調(diào)控，但WWP1是否參與TLR4受體表達的負向調(diào)控尚無有關(guān)研究。
　　 醫(yī)用臭氧可導致脊髓過氧化損傷，其損傷機制與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，而MAPK信號通路是導致細胞凋亡發(fā)生的重要通路之一。目前WWP1參與機體炎性反應的機制研究尚少，是否與機體免疫

9、應答的負向調(diào)控有關(guān)有待進一步闡明。
　　 目的:
　　 本研究通過體外和體內(nèi)實驗觀察不同濃度(20，40，60μg/ml)醫(yī)用臭氧對神經(jīng)細胞和脊髓組織JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的影響，著重從細胞凋亡角度探討JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用機制的可能影響;通過觀察WWP1的過度表達或沉默對LPS所誘導的各通路蛋白和炎性因子表達的影響，著重從Toll樣受體泛素化角度探討WWP1對LPS-TLR4所介導的

10、MyD88信號依賴通路的可能調(diào)節(jié)機制。
　　 方法:
　　 1.觀察不同濃度（20，40，60μg/ml）醫(yī)用臭氧對神經(jīng)細胞的細胞損傷作用
　　 原代大鼠脊髓神經(jīng)元細胞進行MAP-2免疫熒光鑒定后觀察不同濃度臭氧干預下細胞形態(tài)學的改變Hoechst33258熒光染色法觀察細胞和損傷。全細胞膜片鉗觀察低濃度(15，20μg/ml)臭氧對神經(jīng)元鈣電流的影響。MTT和流式細胞技術(shù)檢測脊髓神經(jīng)元和PC12的細胞活力。RT

11、-PCR和Western blotting法檢測細胞內(nèi)Bax和Bcl-2的表達。
　　 2.不同濃度醫(yī)用臭氧作用下神經(jīng)細胞MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的表達變化
　　 Western blotting法檢測不同濃度臭氧（20，40，60μg/ml）作用24h后神經(jīng)細胞內(nèi)JNK，p-JNK，ERK和p-ERK的表達。
　　 3.JNK抑制劑對不同濃度醫(yī)用臭氧誘導神經(jīng)細胞凋亡的影響
　　 神經(jīng)細胞加入JNK特異性抑制

12、劑AS601245(0.1μM)預處理40min，分別進行20，40，60μg/ml臭氧干預。Western blotting檢測JNK和p-JNK蛋白水平表達的變化，MTT和流式細胞技術(shù)檢測神經(jīng)細胞活力，RT-PCR和Western blotting檢測細胞內(nèi)Bax和Bcl-2的表達。
　　 4.大鼠鞘內(nèi)注射模型的建立，觀察不同濃度（20，40，60μg/ml）醫(yī)用臭氧干預后大鼠脊髓組織細胞凋亡的程度及JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導

13、通路的表達變化。
　　 不同濃度臭氧干預24h后，采用BBB評分進行動物神經(jīng)行為學評價。RT-PCR和Western blotting法檢測凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達;Westernblotting法檢測JNK和ERK蛋白的表達。
　　 尾靜脈給予AS601245(4.5mg/kg)6h后鞘內(nèi)注射不同濃度臭氧，注射24h后對大鼠后肢運動功能進行評價，并分別檢測大鼠脊髓組織中Bax、 Bcl-2、JNK、p

14、-JNK、ERK及p-ERK的表達。
　　 5.觀察WWP1對LPS或TNF-α所誘導的炎性反應的影響
　　 通過SiRNA干擾/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)使腹腔巨噬/RAW264.7細胞內(nèi)WWP1沉默或過度表達（野生型和突變型），ELISA和RT-PCR檢測LPS或TNF-α刺激下細胞中TNF-α和IL-6的分泌和表達，Western blotting檢測IRF3、NF-κB和MAPK各通路(JNK、ERK、P38)的蛋白表達。

15、r>　　 6.研究WWP1對LPS-TLR4激活的MyD88信號依賴通路的可能作用位點
　　 采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將已標記的TRAF6和IRAK1分別與WWP1轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，免疫共沉淀技術(shù)檢測WWP1分別與TRAF6和IRAK1的相關(guān)性。Western blotting法檢測WWP1作用下TRAF6和ITAK1的蛋白表達變化，加入蛋白酶抑制劑MG132后檢測TRAF6的蛋白表達變化。
　　 通過SiRNA干擾/

16、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)使腹腔巨噬/RAW264.7細胞內(nèi)WWP1沉默或過度表達（野生型和突變型），Western blotting檢測TRAF6和ITAK1的表達及LPS刺激下TRAF6的泛素化與K48或K63聚泛素化的關(guān)系。
　　 7.體內(nèi)實驗進一步觀察WWP1沉默對LPS所誘導的小鼠肺損傷的保護作用
　　 采用SiRNA干擾技術(shù)使小鼠體內(nèi)WWP1沉默后，通過LPS刺激建立內(nèi)毒素休克模型，ELISA法測定小鼠血清中TNF-α和I

17、L-6的分泌，肺組織化學染色法觀察小鼠肺組織的損傷程度。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用及機制的體外研究
　　 不同濃度（20，40，60μg/ml）臭氧作用后光鏡下可見神經(jīng)細胞內(nèi)大皰形成，神經(jīng)突起扭曲斷裂，Hoechst33258染核后，細胞核高亮濃縮，出現(xiàn)核碎裂及核固縮，該效應與臭氧濃度呈正相關(guān)。與對照組相比，較低濃度臭氧(15，20μg/ml)可使神經(jīng)細胞鈣內(nèi)流增加(P＜0.05)，

18、激活電壓向超極化方向移動(P＜0.05);三組鈣電流穩(wěn)態(tài)失活曲線均無顯著性差異（P＞0.05）。與對照組及較低濃度臭氧20μg/ml組相比，60μg/ml臭氧組能夠顯著抑制神經(jīng)細胞的存活率(P＜0.01);與對照組相比，40μg/ml臭氧組可觀察到大量凋亡的神經(jīng)細胞。RT-PCR和Westernblotting結(jié)果均顯示各臭氧組較對照組神經(jīng)細胞內(nèi)凋亡蛋白Bax表達明顯升高(60μg/ml，P＜0.01)，且具有濃度依賴性，但抗凋亡蛋白B

19、cl-2表達無明顯差異（P＞0.05）。各臭氧組磷酸化JNK蛋白表達與Bax表達水平具有類似趨勢(60μg/ml，P＜0.01)，AS601245預處理后可明顯抑制較高濃度(40μg/mlO3)臭氧所誘導的細胞凋亡(P＜0.05)，顯著降低磷酸化JNK和Bax蛋白的表達水平（P＜0.01）。
　　 2.不同濃度醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用及機制的體內(nèi)研究
　　 與對照組相比，鞘內(nèi)注射不同濃度(20，40，60μg/ml)臭氧后

20、，較高濃度(40，60μg/ml)臭氧組注射后BBB評分與對照組相比明顯降低，且60μg/ml臭氧組脊髓損傷更明顯（P＜0.01）;凋亡蛋白Bax的表達水平隨著臭氧干預濃度的增加而升高(P＜0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Westem blotting結(jié)果顯示p-JNK/MAPK活力隨著臭氧濃度升高而明顯增加（60μg/ml，P＜0.01），尾靜脈給予AS601245預處理后，各臭氧組大鼠BBB評分均有

21、所改善(P＜0.05)，各組p-JNK/MAPK活力明顯降低(P＜0.01)，較高濃度臭氧組（40μg/ml）Bax的表達水平明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.WWP1明顯抑制LPS而非TNF-α刺激下TNF-α和IL-6的表達
　　 Lesh WWP1+LPS組的腹腔巨噬細胞TNF-α和IL-6的表達水平明顯增加(P＜0.01)，而Lesh NC各組及Lesh WWP1+TNF-α組未見明顯差異(P＞0.05);H

22、is-WWP1+LPS組的RAW264.7細胞TNF-α和IL-6的表達水平明顯降低（P＜0.01），而His-Control各組及His-WWP1+TNF-α組及His-C890A各組無明顯變化(P＞0.05);與Lesh NC+LPS組相比，Lesh WWP1+LPS組小鼠血清中TNF-α和IL-6的表達均增加(P＜0.01);同時Lesh WWP1+LPS組小鼠的肺組織學分析呈現(xiàn)出更為嚴重的肺損傷。
　　 4.WWP1抑制

23、LPS誘導下IκB-α，NF-κB及MAPK的活化，而與IRF3的表達無關(guān)
　　 與Lesh NC組相比，Lesh WWP1組中p-IκB-α、p-65、p-JNK、p-ERK、p-P38活力明顯增加，以LPS刺激后90 min增加最明顯，而IRF3的表達無明顯統(tǒng)計學差異;與His-Control組及His-C890A組相比，His-WWP1組中p-IκB-α、p-65、p-JNK、p-ERK、p-P38活力明顯降低，而對IRF

24、3的表達無明顯影響。
　　 5.WWP1對TRAF6而非IRAK1具有明顯的蛋白酶體降解作用
　　 His-WWP1與Myc-TRAF6組出現(xiàn)蛋白共沉淀現(xiàn)象，而與IRAK1無關(guān);His-WWP1和His-C890A兩組均與myc-TRAF6出現(xiàn)免疫共沉淀現(xiàn)象;LPS刺激后(30，60 min)出現(xiàn)WWP1與TRAF免疫共沉淀現(xiàn)象;Myc-TRAF6+His-WWP1組中TRAF6的蛋白表達明顯降低，而WWP1野生型對TR

25、AF6的降解作用可被MG132緩解，myc-TRAF6+His-C890A組中TRAF6的蛋白表達無明顯變化;與Lesh NC組相比，Lesh WWP1組TRAF6的蛋白表達明顯增加，且LPS刺激120min后更明顯;Myc-TRAF6+His-WWP1組中TRAF6的蛋白表達明顯降低，而His-C890A組TRAF6表達無明顯變化。
　　 6.WWP1基因的沉默降低LPS誘導下TRAF6的K48而非K63相關(guān)的泛素化
　

26、　 Lesh NC組TRAF6在LPS刺激下均發(fā)生K48及K63相關(guān)的泛素化，而LeshWWP1組細胞中TRAF6在LPS刺激60 min后只發(fā)生K48相關(guān)的泛素化。
　　 結(jié)論:
　　 1.醫(yī)用臭氧對神經(jīng)細胞具有過氧化損傷作用，較高濃度臭氧(40，60μg/ml)可降低神經(jīng)細胞的存活率，誘導細胞鈣離子內(nèi)流增加，增加凋亡蛋白Bax的表達;鞘內(nèi)注射臭氧可明顯降低大鼠后肢運動功能評分，使脊髓組織中的Bax蛋白過度表達，且具

27、有濃度依賴性。
　　 2.較高濃度臭氧(40，60μg/ml)干預后可增加神經(jīng)細胞和脊髓組織的磷酸化JNK蛋白水平，JNK抑制劑預處理后可明顯降低臭氧引起的神經(jīng)系統(tǒng)的過氧化損傷，降低細胞凋亡率，改善運動功能評分。
　　 3.醫(yī)用臭氧通過JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)Bax蛋白的表達介導脊髓神經(jīng)系統(tǒng)過氧化損傷。
　　 4.WWP1對LPS所誘導的炎性因子TNF-α和IL-6的表達具有抑制作用。
　　 5.