人癌胚抗原轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的出現(xiàn)是20世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域中的重大事件，而生物技術(shù)將是2l世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，是經(jīng)濟(jì)和科技發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)使人們能從整體、器官、細(xì)胞、分子多層次，從發(fā)育時(shí)間和組織生理空間多角度，立體多維地研究基因，并可按人類的意愿改造和修飾物種。 癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)是胚胎發(fā)展中產(chǎn)生的抗原之一，是一種最常見的腫瘤相關(guān)抗原，是目前國(guó)際上公認(rèn)的腫瘤標(biāo)記物。其基因定位于人類19號(hào)

2、染色體長(zhǎng)臂(19q13．1~13．2)，分子量約為180kd,為免疫球蛋白超家族的成員。CEA在正常消化道黏膜僅少量分泌，而90％的消化道惡性腫瘤、胰腺癌，70％非小細(xì)胞肺癌和50％乳腺癌有CEA的高表達(dá)，故CEA可作為這些腫瘤檢測(cè)和治療的靶分子。 本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，用顯微注射法將包含小鼠乳清酸蛋白基因啟動(dòng)子(約2．4kb)、人癌胚抗原的編碼序列(約2．1kb)及polyA信號(hào)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件轉(zhuǎn)入原核期小鼠胚胎，制備了CEA轉(zhuǎn)

3、基因小鼠，旨在研究CEA與乳腺癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為以后制作小鼠乳腺生物反應(yīng)器提供經(jīng)驗(yàn)和參考。主要進(jìn)行了以下工作： 提純pWA-CEA質(zhì)粒，分別進(jìn)行HindIIl單酶切、HindIII和XhoI雙酶切、SaclI和KpnI雙酶切鑒定。對(duì)構(gòu)建成功的pWA-CEA質(zhì)粒用SacII和XpnI雙酶切得到目的基因(約4．9kb)，膠回收并純化目的片斷，溶于TE(10mmol／LTris-HCl．pH7．4；0．2mmol／LEDTA

4、)中，注射用DNA濃度為3μg/ml，儲(chǔ)存-20oc備顯微注射用。將雌鼠做超排卵處理，與正常雄鼠交配，取其受精卵，培養(yǎng)至單細(xì)胞雙原核期，利用顯微注射儀將目的基因注射入受精卵的雄原核內(nèi)，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)篩選后移植入假孕母鼠(系正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配成功)輸卵管內(nèi)，共產(chǎn)下¨1只后代小鼠。其中7只產(chǎn)下后不明原因死亡，存活下來104只。兩周齡時(shí)，剪鼠尾組織提取基因組DNA。根據(jù)人癌胚抗原基因cDNA的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其序列如下： Pl：

5、5'-GCCCCAGCATCITIT-FGGCTACA-3’ P2：5'-ACTGCGCCTGGCACTCACTGG-3 預(yù)計(jì)P1、P2的擴(kuò)增長(zhǎng)度為505bp。取G0代小鼠基因組DNA作為模板，同種非轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA及注射用外源基因作為陰性、陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)過反復(fù)調(diào)整退火溫度、變性、復(fù)性的時(shí)間，調(diào)整PCRBuffer中Mg2+濃度最適為1．2mmol／L，獲得了穩(wěn)定的擴(kuò)增效果，共得到n只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。

6、為了提高PCR結(jié)果的特異性，我們將第一次PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR產(chǎn)物回收純化，用同一對(duì)引物、反應(yīng)條件再進(jìn)行第二次PCR篩選，得到3只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠。將這3只陽(yáng)性鼠的PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果顯示3只均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠。以限制性內(nèi)切酶XhoI／HindI]I雙酶切質(zhì)粒pWA-CEA，回收并純化目的片斷(人癌胚抗原基因cDNA，約2．1kb)用作標(biāo)記探針的模板，用Roche公司地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒I對(duì)模板進(jìn)行探針標(biāo)記和檢測(cè)。用HindI

7、II和XhoI消化第一次PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA，用地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記人癌胚抗原基因cDNA為探針，與11只陽(yáng)性小鼠的DNA進(jìn)行雜交，其中3只小鼠在2．1kb處出現(xiàn)明顯的雜交帶，與第二次PCR產(chǎn)物測(cè)定序列結(jié)果相符。在出生的后代小鼠中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率約為2．7％(3／111)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論： 1．將構(gòu)建好的PWA-CEA質(zhì)粒，用SacⅡ和KpnI雙酶切回收注射用目的基因片段，酶切電泳，與理論值相符。

8、 2．將目的基因片段通過顯微注射原核期小鼠胚胎，用Southernblot雜交確認(rèn)在出生的111只小鼠中有3只為轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為2．7％(3／111)。 3．在目的基因的整合檢測(cè)中，對(duì)第一次陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR篩選大大提高PCR的特異性，降低了假陽(yáng)性，是一種簡(jiǎn)便可行的方法。 4．搭建了小鼠乳腺生物反應(yīng)器的開發(fā)平臺(tái)。 通過該研究，我們建立了人癌胚抗原轉(zhuǎn)基因小鼠模型。以此為基礎(chǔ)，在下一步的研究中