磁珠-寡核苷酸微陣列多重可擴增探針雜交技術的建立及在杜氏肌營養(yǎng)不良檢測中的應用.pdf

1、目的：杜氏進行性肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是一種有嚴重危害的X染色體隱性遺傳病，在各類遺傳病中，杜氏進行性肌營養(yǎng)不良癥是發(fā)病率最高的疾病之一。DMD患者為男性，女性為攜帶者。男孩在2歲左右發(fā)病，癥狀嚴重，多于20歲之前死于呼吸衰竭，循環(huán)衰竭。隨著現代醫(yī)學的發(fā)展，人們正在積極努力地尋求治療此病的方法。但是，到目前還沒有任何方法可以徹底治愈該病。因此，對杜氏進行性肌營養(yǎng)不良癥進行準確，全面的癥前診斷及產前診斷，防止患兒出生是針對此病最重要的措施

2、。建立一種快速，準確，全面的檢測方法是診斷該病的迫切要求。 方法：應用了一種基因缺失檢測的新技術—多重可擴增探針雜交技術(MAPH)檢測了5例正常對照和5例臨床已診斷為DMD缺失的樣品。該方法針對進行性肌營養(yǎng)不良基因79個外顯子中的52個外顯子進行缺失的檢測，根據進行性肌營養(yǎng)不良基因cDNA相關序列，對該52個外顯子設計了特異性引物和芯片上寡核苷酸探針。用特異性引物經PCR分別擴增出各外顯子序列，并進行克隆，使各外顯子序列前后都

3、帶有相同的載體序列。用通用引物擴增出的具有通用引物序列的PCR產物作為可擴增探針組，與固定在磁珠上待測的基因組DNA雜交，并用磁珠回收特異性雜交的探針，回收的探針經擴增及熒光標記后，與相應的寡核苷酸芯片雜交，數據分析，以達到檢測DMD外顯子缺失的目的。本試驗以磁珠替代了傳統MAPH技術中應用的尼龍膜，磁珠是一種進行雜交反應的載體，其上帶有被酶切的DNA片段，在其適宜的雜交緩沖液下，與所要檢測的各外顯子的探針雜交，當待檢者DNA片段與某段

4、探針完全匹配時，此探針則結合到磁珠上去，若待檢者DNA上dystrophin基因有缺失，則相應缺失部位的探針不能與磁珠結合，經磁珠緩沖液的清洗，只有結合到磁珠上的探針才能被回收。傳統MAPH方法中，由于尼龍膜面積小(2mm×3mm)，在多次轉移，清洗過程中，尼龍膜上DNA或探針易受損并且易受污染，影響檢測結果。與尼龍膜相比，磁珠有操作簡便，回收探針效率高等優(yōu)點。 傳統的MAPH方法在探針組回收后經多重PCR擴增，通過電泳技術檢測

5、雜交回收的探針，仍存在檢測通量的限制。應用寡核苷酸芯片來檢測雜交回收的探針，寡核苷酸芯片的主要原理是通過堿基互補配對原則進行雜交，以檢測對應片段是否存在、存在量的多少，該方法可使檢測通量極大的提高，結果也更直觀，應用圖像分析軟件對芯片進行定量分析，結果更加精確。 結論：磁珠—寡核苷酸微陣列多重可擴增探針雜交技術應用磁珠代替尼龍膜進行MAPH方法的檢測更加簡便，應用基因芯片作為檢測工具使結果更加直觀，也便于將各熒光信號應用分析軟件

6、進行分析，有效減少了人為判斷誤差。尼龍膜與探針雜交后，探針的回收一直是整個MAPH方法的關鍵問題，在傳統的MAPH方法中探針的回收率很低，用磁珠代替尼龍膜雜交后，其探針回收率較高，使整個試驗的成功率大大提高。目前對進行性肌營養(yǎng)不良大部分外顯子缺失的檢測在國內還未見報道。本文應用MAPH檢測技術結合磁珠及寡核苷酸芯片技術檢測DMD患者外顯子缺失可達52個，在國內尚數首次。結果證明磁珠—寡核苷酸微陣列多重可擴增探針雜交方法是一種檢測通量高，