自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞及磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪細胞作用的實驗研究.pdf

1、一、自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的實驗研究 研究背景：種子細胞是組織工程化組織能夠再生的首要物質(zhì)基礎。干細胞由于其體外高增殖率和多向分化潛能成為種子細胞研究的熱點。近年來，研究顯示脂肪基質(zhì)細胞中存在著一定量的干細胞(稱為脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞，AMSCs)，在一定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞及神經(jīng)細胞方向分化。雖然對AMSCs的初步研究有一定的成果，但是其中仍有許多問題有待闡明。如脂肪

2、組織中是否真正存在一類干細胞，這類干細胞是否是周圍血中MSCs透過血液向脂肪組織中的滲透。如何在體外構(gòu)建一種簡單、經(jīng)濟、易推廣的培養(yǎng)方法。分化后的細胞是否來源AMSCs，以及AMSCs的免疫性如何等都是有待探討的地方。 目的：探索人脂肪組織源性間充質(zhì)干細胞(AMSCs)的分離、體外培養(yǎng)方法，以及生物學特性，為其廣泛應用提供實驗依據(jù)。 方法：無菌條件下獲取腹部手術(shù)病人皮下脂肪組織，酶消化法分離、培養(yǎng)AMSCs，觀察細胞形態(tài)

3、并繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間。對第2代細胞進行免疫組織化學染色，鑒定其表面分子CD44表達。取2～4代細胞用含體積分數(shù)為10％胎牛血清，1％青鏈霉素原液，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，0.5mmol/LIBMX的高糖DMEM培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)兩周，觀察細胞形態(tài)變化，并用油紅“O”染色定性。 結(jié)果：人脂肪組織中含有大量間充質(zhì)干細胞，接種后細胞在24小時內(nèi)貼壁，初為小圓形，2～4天可見細胞伸展，大多數(shù)細胞

4、為長梭形，呈成纖維細胞樣貼壁生長，其間也可見形態(tài)、體積不一的多種細胞成分。此后細胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細胞7～10天即達70％～80％融合，可進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代后細胞形態(tài)無大變化，體外培養(yǎng)10代以后，細胞的增殖速度無明顯減慢。細胞群體倍增時間為55小時左右。免疫化學染色鑒定70％的培養(yǎng)細胞呈CD44陽性。加入成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)2～4天后，培養(yǎng)皿中就出現(xiàn)含有空泡的脂肪細胞，1周后達高峰，同時細胞中小脂滴開始融合，形成大的脂滴，并開

5、始向外界分泌，油紅”O(jiān)”染色后細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明細胞內(nèi)顆粒確為脂滴。 結(jié)論：1、本實驗用酶消化法成功的從人體脂肪組織中培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)方法比較經(jīng)濟、簡便，容易推廣。2、用免疫組化染色對培養(yǎng)出的細胞進行表面標志CD44分子的鑒定，結(jié)果顯示70％的培養(yǎng)細胞陽性表達CD44分子，表明在人體脂肪組織中含有可為組織修復所利用的間充質(zhì)干細胞，但細胞成分并不純。3、用含有胰島素、地塞米松及異丁基甲基黃嘌呤的成脂培養(yǎng)基成功

6、誘導脂肪間充質(zhì)干細胞分化成為成熟的脂肪細胞，誘導作用明顯，方法簡便。 二、磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪細胞作用研究 研究背景：近年來，可注射性磷脂酰膽堿合劑被用于注射溶脂領(lǐng)域，即在需要減肥的部位皮下注射一種磷脂酰膽堿合劑以達到溶解脂肪的效果。此種方法由于簡單、易行，病人不用承受痛苦，不用造成新的創(chuàng)傷等優(yōu)點而有著廣闊的應用前景。但對磷脂酰膽堿是否能溶解脂肪組織、對于人體是否有副作用以及溶解脂肪后的轉(zhuǎn)歸都有待探討。國內(nèi)外均缺

7、乏相關(guān)的基礎研究。 目的：探索磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞(AMSCs)向成熟脂肪細胞分化時細胞內(nèi)脂肪積聚，以及對成熟脂肪細胞活性的作用。探討其作為皮下注射溶脂藥物的可能性。 方法：體外培養(yǎng)人皮下脂肪組織的脂肪干細胞，在其成脂培養(yǎng)基中分別加入不同濃度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿，油紅“O”染色提取法測定細胞內(nèi)脂肪含量，在酶標儀上測定OD值，運用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。用不同濃度

8、(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿干預成熟脂肪細胞生長，分別在干預3天、5天、7天后用吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)染色觀察細胞活性情況。 結(jié)果：磷脂酰膽堿可明顯抑制脂肪干細胞向成熟脂肪細胞分化時胞內(nèi)脂肪積聚，統(tǒng)計學結(jié)果顯示，時間相同時各濃度之間OD值與空白對照組比較均有顯著性意義(P＜0.05)，濃度相同時，隨著時間變化，各時間組OD值之間均有顯著性差異(P＜0.05)；AO/EB染色：空白對照組的核染色顯示明亮

9、的綠色熒光，顯示細胞活性良好。和同時間的空白對照組比較，0.05％濃度的磷脂酰膽堿對成熟脂肪細胞作用3天后表現(xiàn)為誘導凋亡作用，核黃綠色，呈固縮狀。0.5％濃度在作用3天、5天、7天后細胞均表現(xiàn)為壞死狀態(tài)，核呈橘紅色熒光。5％濃度對細胞破壞最為嚴重，作用5天時細胞開始完全壞死，出現(xiàn)細胞溶解，作用7天時幾乎看不到細胞結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：1、磷脂酰膽堿對脂肪干細胞分化過程中脂肪積聚呈抑制作用。時間相同時，濃度越高，這種抑制作用越明顯，濃度相