不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細胞間差異表達基因的篩選及功能初步研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是我國南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性腫瘤，具有明顯的種族聚集性和地域性。目前普遍認為鼻咽癌是在多種因素協(xié)同作用下，經(jīng)過多步驟、多階段發(fā)生發(fā)展形成的，其發(fā)生可能與遺傳因素、EBV感染、理化環(huán)境因素等[1]有關。 鼻咽癌具有頸淋巴結轉(zhuǎn)移早，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高等特點，但是目前對鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制尚不十分清楚，進一步篩選和鑒定鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關基因，并明確其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作

2、用，對于揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制有著重要意義，也對鼻咽癌的治療及預后判斷具有重要的理論和實用價值。 細胞的表型由它所表達的基因種類、表達水平和時空順序等因素所決定。通過比較遺傳背景相同、轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細胞間的基因表達差異這一途徑尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因，是一種已經(jīng)得到公認的篩選策略，但前提條件是要獲得具有相同遺傳背景、轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細胞。鼻咽癌細胞5-8F和6-10B均來源于同一母細胞株SUNE-1，既往的研究已經(jīng)證實，5-

3、8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力，而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。比較基因組雜交(CGH)的研究結果也表明，5-8F和6-10B細胞在多條染色體上存在缺失、擴增等差異。這兩株細胞來自同一親本，具有相同的遺傳背景，兩者間的差異主要集中在轉(zhuǎn)移能力上，它們之間的差異表達基因很可能與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關，是用于尋找鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關候選基因的理想材料。 本研究首先利用抑制性消減雜交技術，以具有不同轉(zhuǎn)移能力的兩株鼻咽癌細胞5-8F和6-10B為材料，建立了

4、兩者間差異表達基因的消減cDNA文庫并從中篩選出多個在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細胞5-8F中表達上調(diào)的基因。通過檢索既有文獻中相關基因功能的報道，分析這些基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中可能的作用。在此基礎上，我們選擇了差異表達基因Flotillin-2為目標進行后續(xù)研究。利用RNA干擾技術選擇性地沉默5-8F細胞中Flotillin-2基因的表達，通過觀察Flotillin-2基因被干擾后對5-8F細胞生物學特性的影響，明確Flotillin-2基因在5-8F

5、細胞中的作用，為Flotillin-2基因與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的相關性提供實驗證據(jù)。實驗方法和結果如下：第一部分：不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細胞間差異表達基因的篩選采用抑制性消減雜交技術，以高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細胞5-8FcDNA為檢測子，以不轉(zhuǎn)移鼻咽癌細胞6-10BcDNA為驅(qū)趕子，通過兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR，構建了兩者間差異表達基因的消減cDNA文庫，得到了上千個差異表達克隆。從該文庫中隨機挑取192個克隆，采用PCR擴增插入cDNA片段，經(jīng)0.4

6、NNaOH裂解變性后，按8×12矩陣方式制備了兩張斑點雜交膜，分別與經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄標記的5-8F細胞和6-10B細胞的第一鏈cDNA行反向Northern斑點雜交。雜交信號經(jīng)掃描和對比分析后，獲得了差異表達點，對存在2倍差異以上的克隆進行了序列測定，獲得了在5-8F細胞中表達上調(diào)的20個差異表達基因的cDNA序列。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中16個為已知基因(flotilin-2，ezrin,pim-3,fli-1，mel，n

7、eugrin，znf216,ASBl，raly,UBE2A，keratin6A，TMED7,EIF3S9,FTL,RPL21及RPL16)，2個為通過電子克隆預測出的基因(c9orf74和MDS006)，2個代表新基因序列。這些差異表達基因的功能涉及到細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞運動、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復、蛋白質(zhì)合成與運輸?shù)榷鄠€方面。除少部分基因(ezrin、fli-1、flotillin-2、pim-3)有過報道外，大部分基因是首

8、次發(fā)現(xiàn)可能與轉(zhuǎn)移表型有關，提示在這些差異表達基因中可能存在鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關候選基因。RT-PCR分析表明，與6-10B相比，F(xiàn)lotillin-2基因在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細胞5-8F中的表達明顯上調(diào)。相關文獻檢索結果也提示，F(xiàn)lotillin-2基因有作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關候選基因的功能基礎和可能性。 第二部分用RNA干擾技術研究Flotillin-2基因在5-8F細胞的作用采用pSUPER.retro逆病毒載體系統(tǒng)，分別構建了針對Flot

9、illin-2的兩個RNAi載體(shFlot2-1和shFlot2-2)。經(jīng)測序結果證實后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將shFlot2-1和shFlot2-2分別導入5-8F細胞，嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆，PCR證實抗性克隆中含有shFlots；RT-PCR結果表明，shFlot2-1和shFlot2-2表達載體均特異性的引起Flotillin-2的表達下調(diào)，對其它無關基因沒有影響，而且shFlot2-2比shFlot2-1具有更好的RNA干

10、擾效果；WesternBlotting分析表明5-8F-shFlot2-2細胞中Flotillin-2的蛋白表達下調(diào)了75％以上，這些說明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFlots的5-8F細胞系。 隨后，我們進一步考察了Flotillin-2的表達被干擾后對5-8F細胞的生物學特性的影響。流式細胞分析結果表明，轉(zhuǎn)染pSUPER.retro空白載體的5-8F細胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F細胞的細胞周期分布沒有明顯改變；而轉(zhuǎn)染shFlot2-

11、2后可以使5-8F細胞停滯于G1期，G1期細胞比例增加(59.11％vs46.28％/44.99％)，S期(30.49％vs39.71％/40.58％)和G2/M期細胞比例減少(10.41％vs14.01％/14.43％)。 MTT法觀察5-8F-shFlot2細胞的增殖能力，以轉(zhuǎn)染pSUPER.retro空白載體的5-8F細胞和未轉(zhuǎn)染5-8F細胞作為對照，觀察5-8F-shFlot2-2細胞的增殖情況，結果表明5-8F-shF

12、lot2細胞的增殖速度明顯低于對照組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性(P＜0.05)；雙層軟瓊脂集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，5-8F-shFlot2-2細胞形成的集落數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05)。提示Flotillin-2被干擾后導致5-8F細胞的增殖能力和克隆形成能力降低。 利用劃痕實驗和Matrigel侵襲模型證實，F(xiàn)lotillin-2被干擾后5-8F細胞的侵襲能力和運動能力減弱。裸鼠腹腔內(nèi)接種后成瘤及轉(zhuǎn)移能力的比較分析結果進一步提示，

13、Flotillin-2被干擾后5-8F細胞的成瘤能力不受影響，轉(zhuǎn)移能力下降。 本實驗利用抑制性消減雜交技術，構建了不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細胞間差異表達基因的消減cDNA文庫，利用反向Northern斑點雜交篩選出了20個在5-8細胞中表達上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)其中16個為已知基因，2個為通過電子克隆預測出的基因，2個代表新基因序列，為進一步篩選鼻咽癌候選轉(zhuǎn)移相關基因奠定了良好的實驗基礎。利用RNA干擾技術，建立了穩(wěn)定表達shFlot2的干擾