益心康對柯薩奇病毒感染大鼠心肌細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，建立柯薩奇病毒體外感染心肌細(xì)胞模型，探討益心康對感染CVB3病毒心肌細(xì)胞的保護(hù)及對病毒的抑制作用，為該藥的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：體外原代培養(yǎng)3天的SD大鼠心肌細(xì)胞。
　　 2、Hela細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 3、制備病毒：擴增CVB3病毒的毒力，測定CVB3病毒的毒力(TCID50)。
　　 4、制備益心康提取物。

2、
　　 5、測定益心康提取物及利巴韋林注射液對心肌細(xì)胞的最大無毒劑量(TCID0)。
　　 6、藥物的干預(yù)：取單層生長狀態(tài)良好的乳鼠心肌細(xì)胞，分成4組：①細(xì)胞對照組;②病毒對照組;③益心康組;④利巴韋林組。培養(yǎng)24h、48h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，待病毒對照組CPE出現(xiàn)100％（++++）時，停止培養(yǎng)。
　　 7、療效指標(biāo)的檢測
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察各組24小時、48小時心肌細(xì)胞的形

3、態(tài)學(xué)變化及CPE情況。
　　 (2)MTT法測定48小時各組心肌細(xì)胞存活率。
　　 (3)ELISA法測定48小時各組CK-MB及cTnI，比較益心康及利巴韋林對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 (4)RT-PCR法測定各組柯薩奇病毒mRNA的含量，比較益心康及利巴韋林對柯薩奇病毒復(fù)制的抑制作用。
　　 8、統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)處理用(-X)±SD表示，各組均數(shù)比較采用方差分析及兩

4、兩比較，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、形態(tài)學(xué)觀察：觀察各組心肌細(xì)胞24小時、48小時的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞病變(CPE)。正常對照組24小時、48小時心肌細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞生長旺盛，向周圍伸出放射狀突起，心肌細(xì)胞呈同步搏動，節(jié)律規(guī)整，搏動有力，60-80次/min；病毒對照組心肌細(xì)胞，在接種病毒24小時后，細(xì)胞仍搏動但速度較慢，節(jié)律欠規(guī)整，開始出現(xiàn)細(xì)胞病變。接種病毒48小時

5、后，可見細(xì)胞團(tuán)縮、破碎等細(xì)胞病變，基本停止搏動；益心康組、利巴韋林組與病毒對照組比較，病變明顯減輕，益心康組細(xì)胞病變輕于利巴韋林組。
　　 2、用MTT法測定各組細(xì)胞存活率結(jié)果顯示：正常組、益心康組、利巴韋林組細(xì)胞存活率均明顯高于病毒對照組；益心康組細(xì)胞存活率高于利巴韋林組。
　　 3、ELISA法測定各組CK-MB及cTnI的結(jié)果顯示：正常細(xì)胞組、益心康組、利巴韋林組細(xì)胞上清液CK-MB、cTnI均明顯低于病毒對照組，

6、益心康組CK-MB、cTnI低于利巴韋林組。
　　 4、應(yīng)用RT-PCR法測定各組心肌細(xì)胞mRNA的含量顯示：正常細(xì)胞組未檢測到CVB3病毒，而益心康組和利巴韋林組在感染CVB3病毒48小時后CVB3病毒含量均低于病毒對照組；病毒對照組與益心康組和利巴韋林組比較，有顯著性差異，益心康組心肌細(xì)胞病毒含量略低于利巴韋林組，益心康和利巴韋林比較無顯著性差異。
　　 結(jié)論
　　 1、益心康具有保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕心肌細(xì)胞病