維持體外擴增臍帶血干細胞干性-下調(diào)異常升高的ROS和p38MAPKα信號.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、細胞內(nèi)ROS 對臍帶血CD133+細胞體外擴增特性的影響
　　 目的：使用抗氧化劑NAC 調(diào)節(jié)體外擴增細胞內(nèi)活性氧水平，評估ROS 對臍帶血CD133+細胞體外擴增特性的影響，并初步探討其作用機制。
　　 方法：建立臍帶血CD133+細胞無血清培養(yǎng)體系，CD133+細胞培養(yǎng)過程中分別采用不同濃度的抗氧化劑NAC 清除細胞內(nèi)ROS，檢測不同時間點細胞內(nèi)ROS 水平，并通過CD13

2、3+細胞亞群變化、CFU 及CAFC 評估擴增后細胞功能。同時檢測擴增后細胞增殖(CFSE)、細胞凋亡、衰老表型及相關(guān)基因p16INK4和 p21WAF1的表達，探討ROS作用機制。
　　 結(jié)果：臍帶血CD133+細胞體外擴增過程中胞內(nèi)ROS 升高，并伴隨著HSC 自我更新能力損傷。抗氧化劑NAC 可以有效清除胞內(nèi)ROS，并且清除程度與藥物劑量呈正相關(guān)。其中低劑量處理組(0.1mmol/L)的CD133+細胞擴增倍數(shù)、產(chǎn)生CFU

3、細胞密度、CAFC 形成能力均高于對照組（p<0.05）。NAC 高劑量組(1.0mmol/L)CD133+細胞擴增倍數(shù)低于對照組（p<0.01），但CFU 及CAFC 形成能力強于對照組（p<0.01）。
　　 NAC 可以明顯抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。高劑量的NAC 抑制細胞增殖水平。
　　 結(jié)論：ROS 參與調(diào)節(jié)CD133+細胞體外擴增，適當(dāng)?shù)慕档蚏OS 可促進擴增細胞干性的維持，過度清除ROS

4、則抑制細胞增殖。ROS 主要通過調(diào)控細胞增殖、凋亡及衰老途徑發(fā)揮作用。
　　 第二部分、抑制活化的p38 MAPKα促進臍帶血造血干細胞體外擴增
　　 目的：應(yīng)用p38MAPKα抑制劑及NOD/SCID 小鼠人造血干細胞移植模型評估p38MAPKα對臍帶血CD133+細胞體外擴增特性的影響，并初步探討其作用機制。
　　 方法：建立臍帶血CD133+細胞無血清無基質(zhì)培養(yǎng)體系，CD133+細胞培養(yǎng)過程中采用p38MA

5、PKα抑制劑阻斷p38MAPKα活化，檢測不同時間點及不同處理組細胞內(nèi)p38MAPK 活性，并通過CD133+細胞亞群變化、CFU、CAFC、細胞遷移率及CXCR4表達水平評估擴增后細胞特性，運用NOD/SCID 小鼠人造血干細胞移植模型評估擴增后細胞長期造血重建能力。同時檢測擴增后細胞CFSE 增殖、細胞凋亡、衰老表型及相關(guān)基因p16INK4和 p21WAF1的表達，探討p38MAPKα作用機制。
　　 結(jié)果：細胞體外擴增過程

6、中p38MAPKα被激活，并伴隨著HSC 自我更新能力損傷。p38MAPKα抑制劑抑制p38MAPKα活化后，促進了臍帶血CD133+細胞體外擴增，代表早期干祖細胞的CD133+細胞亞群、CD133+CD38-細胞亞群、CD133+CXCR4+細胞亞群、CFU-GEMM 及CAFC 相較于對照組均明顯增加（p<0.01）。NOD/SCID 小鼠人造血干細胞移植模型中，p38MAPKα抑制劑組的移植物植入率及移植物嵌合率均高于對照組（p<

7、0.01）。機制檢測顯示p38MAPKα抑制劑可以明顯抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，促進細胞向髓系祖分化，對細胞分裂增殖無明顯作用。
　　 結(jié)論：p38MAPKα參與調(diào)節(jié)CD133+細胞體外擴增，抑制p38MAPKα激活可促進HSC 擴增，并維持HSC 干性。主要通過抑制細胞凋亡及衰老途徑發(fā)揮作用。
　　 第三部分、ROS與p38MAPKα在臍帶血CD133+細胞體外擴增中的相互關(guān)系的研究
　　 目

8、的：分別單用或聯(lián)合應(yīng)用p38MAPKα抑制劑SB203580 及抗氧化劑NAC 調(diào)節(jié)體外擴增，比較與評估不同作用靶點對臍帶血CD133+細胞體外擴增特性的影響，探討ROS與p38MAPK在臍帶血CD133+細胞體外擴增中的相互關(guān)系。
　　 方法：分別采用不加藥物、單用p38MAPKα抑制劑SB203580、單用抗氧化劑NAC、聯(lián)合應(yīng)用p38MAPKα抑制劑SB203580 及抗氧化劑NAC 干預(yù)體外擴增，監(jiān)測胞內(nèi)ROS 水平及p

9、38MAPK 活化狀態(tài)，通過CD133+細胞亞群變化、CFU 及CAFC 評估并比較各處理組擴增后細胞特性差異。
　　 結(jié)果：兩藥聯(lián)用下ROS 抑制作用最強，下降到同期對照組的15.3±2.1％，SB203580 處理組為52.0±7.8％，NAC組為63.4±9.0％，SB 抑制效果優(yōu)于NAC。
　　 p38MAPKα抑制劑及抗氧化劑NAC 對p38MAPKα活化均有抑制作用。相對于初始細胞，SB組擴增效率最高，CD1