基于乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記—液相色譜—傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組研究策略的建立、評(píng)價(jià)與應(yīng)用.pdf

1、本研究目的是開發(fā)一整套具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和液質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量新策略，實(shí)現(xiàn)高通量，高準(zhǔn)確性，高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，用來克服商業(yè)化試劑存在的不足，擺脫對(duì)于商業(yè)化標(biāo)記試劑的依賴性。 首先建立和優(yōu)化了一種針對(duì)肽段還原性氨基的乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記方法。該方法經(jīng)條件優(yōu)化后具有以下優(yōu)點(diǎn)：乙酰化穩(wěn)定同位素試劑用量少，副反應(yīng)少，能標(biāo)記樣品中全部蛋白質(zhì)或肽段，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)或肽段的質(zhì)量差可以預(yù)測(cè)，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，標(biāo)記過

2、程反應(yīng)條件溫和，標(biāo)記基團(tuán)在多維色譜分離條件中穩(wěn)定，標(biāo)記基團(tuán)在質(zhì)譜分析中穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生額外的碎片離子，標(biāo)記方法能夠應(yīng)用于包括人體在內(nèi)的所有生物樣本并且試劑廉價(jià)易得。但是單純的乙酰化標(biāo)記方法標(biāo)記位點(diǎn)是還原性的氨基端，每個(gè)肽段至少標(biāo)記上一個(gè)乙?；鶊F(tuán)(即至少摻入3個(gè)氘原子)，盡管氘原子數(shù)量的增加可以避免標(biāo)記肽段間同位素峰重疊問題，但是隨著摻入的氘原子數(shù)量的增加而引起的反相色譜中的同位素效應(yīng)也會(huì)增加。為了減少由于同位素效應(yīng)引起的標(biāo)記肽段色譜保留時(shí)

3、間滯后，從而造成質(zhì)譜分析的誤差，構(gòu)建了基于納升級(jí)反相色譜分離、在線點(diǎn)靶和MAIDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用的定量策略。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物的定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明該策略完全可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在規(guī)模化蛋白質(zhì)鑒定分析中，電噴霧離子源(ESI)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離源(MAIDI)質(zhì)譜相比，前者使用更為廣泛。因此，為了能夠?qū)⒁阴；瘶?biāo)記方法與在線色譜分離和納升級(jí)電噴霧離子源的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀聯(lián)用，同時(shí)提

4、高乙?；瘶?biāo)記方法的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，本研究又發(fā)展了一種胍基化修飾乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記方法。該方法除了具有上述乙?；瘶?biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)之外，由于胍基化修飾的乙?；臉?biāo)記方法保證了每個(gè)肽段只會(huì)被一個(gè)乙?；鶚?biāo)記(即只有3個(gè)氘原子的摻入)，因此很好的控制了氫氘同位素試劑在反相色譜中的同位素效應(yīng)，同時(shí)提高了標(biāo)記肽段在質(zhì)譜中的靈敏度。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物體系的定量分析實(shí)驗(yàn)，表明該策略定量分析準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)。 在胍基化修飾的乙?；瘶?biāo)記方法建立的

5、基礎(chǔ)上，根據(jù)標(biāo)記方法和所使用的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的特點(diǎn)，自主開發(fā)了一套自動(dòng)化數(shù)據(jù)定量分析軟件MSAQ，用于規(guī)?；亩坑?jì)算。 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)本研究中建立的基于胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記，液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略在生物樣本中應(yīng)用的可行性，將該策略在三種不同的復(fù)雜生物樣本體系中進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，獲得了滿意的結(jié)果。 將該策略應(yīng)用于大腸桿菌N

6、末端肽組學(xué)研究中。在整體蛋白質(zhì)水平胍基化后的氫代氘代乙?；瘶?biāo)記，既提高了肽段在質(zhì)譜中檢測(cè)靈敏度，又實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)N末端肽的特異性同位素標(biāo)記，因而易于從一級(jí)質(zhì)譜圖中識(shí)別N末端肽同時(shí)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序分析。77種大腸桿菌蛋白質(zhì)的N-末端序列被確定，其中46種蛋白質(zhì)N-末端序列信息和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)完全一致，另外31種蛋白質(zhì)的甲硫氨酸是否去除的信息在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有詳細(xì)注釋，而通過我們實(shí)驗(yàn)對(duì)該31種蛋白質(zhì)甲硫氨酸是否去除進(jìn)行了精確測(cè)定，另

7、外確證了9種蛋白質(zhì)的N末端是以信號(hào)肽去除的方式存在。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的定量蛋白質(zhì)組策略不僅能對(duì)蛋白質(zhì)的N末端進(jìn)行規(guī)?；奶禺愋宰R(shí)別和測(cè)序，還能對(duì)N末端的翻譯后修飾(如甲酰甲硫氨酸和信號(hào)肽去除問題)進(jìn)行精確測(cè)定。該策略與傳統(tǒng)的Edman降解具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和通量化的優(yōu)點(diǎn)，因而在蛋白質(zhì)N末端測(cè)序領(lǐng)域有著更加廣泛的應(yīng)用前景。其次，將該策略應(yīng)用于代謝蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。對(duì)由四氯化碳(CCl<,4>)造成的大鼠肝損傷組織CY

8、P450蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行了定量研究，17種CYP450蛋白質(zhì)被定量分析，其中2E1的表達(dá)量顯著下調(diào)，該結(jié)果驗(yàn)證了由于2E1介導(dǎo)的CCl4的代謝產(chǎn)生活潑的自由基，從而導(dǎo)致2E1蛋白比之其他CYP450蛋白質(zhì)更容易受到CCl<,4>毒理性的影響的論斷。同時(shí)除了2E1表達(dá)量顯著變化外，其他幾種CYP450蛋白質(zhì)表達(dá)量同時(shí)也發(fā)生了顯著性的變化，說明本研究中所使用的規(guī)?；亩糠治鍪侄?，不僅可以對(duì)于已有研究結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)還可以揭示其他CYP4

9、50蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。 最后，將該策略應(yīng)用于血漿定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。血漿蛋白質(zhì)組成與細(xì)胞、組織與器官的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。由于血漿蛋白質(zhì)含量動(dòng)態(tài)范圍非常寬(>10<'12>)，因而，如果能夠?qū)ρ獫{蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量化、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的定量分析，是對(duì)本研究中所建立的整套定量分析策略最好的評(píng)價(jià)。 (1)對(duì)正常血漿樣本進(jìn)行了1：1標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差小于5％。 (2)對(duì)處于肝炎不同階段的血漿樣本

10、進(jìn)行了定量研究，總共對(duì)1025種血漿蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，其中具有2倍以上顯著性差異的蛋白質(zhì)有185種。包括了在血漿中濃度只有20ng/ml的Heparin cofactor 2 precursor，和濃度小于10pg/ml Angiotensinogen precursor，該結(jié)果表明本標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)范圍達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)的血漿蛋白質(zhì)定量分析(albumin，35mg/mL-Angiotensinogenprecursor,<10pg/

11、mL)(3)為了進(jìn)一步驗(yàn)證定量結(jié)果的可靠性，對(duì)其中一種差異顯著的蛋白質(zhì)Fibronectin進(jìn)行了western驗(yàn)證。分析顯示western定量結(jié)果和質(zhì)譜定量結(jié)果一致。 綜上所述，本研究建立的基于胍基化乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記，液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新策略，既能夠?qū)碜杂谠松锏臉颖具M(jìn)行分析，又能夠?qū)碜哉婧松锏臉颖具M(jìn)行分析，既能夠分析組織樣本又能夠分析體液樣本。