靶向Neuropilin-單克隆抗體抑制膠質瘤細胞U251對Fibronectin的粘附作用及其機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腦膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性腫瘤，大多數為浸潤性和膨脹性生長，預后相對較差。據美國統(tǒng)計的資料顯示，在所有膠質細胞瘤中約占半數的膠質母細胞瘤患者1年生存率約30％，5年生存率不到5％。盡管目前采取最大限度的手術切除及術后放療與化療結合等綜合治療，但是惡性膠質瘤(malignant gliomas，MG)的臨床預后仍不樂觀。目前分子靶向治療已經成為近年來腫瘤治療的熱點，但是靶向治療腫瘤的效果仍然十分有限，因此

2、，發(fā)現新的腫瘤治療靶點顯得極為重要。人神經菌毛索1(Neuropilin-1，NRP-1)是一種新型的多功能受體，近年來，大量研究結果顯示NRP-1可表達于新生血管的內皮細胞和多種腫瘤細胞，并參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等過程。研究表明，NRP-1在膠質瘤的各個發(fā)展階段都有較高的表達，被認為是一個很有希望的治療新靶點。本文旨在利用本實驗室制各的抗NRP-1單克隆抗體針對膠質瘤細胞U251的粘附抑制作用及其機制做進一步的研究。
　

3、　 實驗方法:
　　 將雜交瘤細胞腹腔種植于Balb/c鼠、生產抗NRP-1單克隆抗體腹水，抗體用rProteinA親和柱純化，利用間接ELISA，Westernblot，流式細胞術和細胞免疫熒光染色對生產的單克隆抗體的特異性和親和力進行檢測。免疫印跡法(Western blot)及細胞免疫熒光檢測NRP-1蛋白在膠質瘤細胞株U251的表達。通過粘附實驗研究NRP-1單克隆抗體對膠質瘤細胞株U251粘附的影響。通過共聚焦熒光顯

4、微鏡觀察羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色后NRP-1單克隆抗體對膠質瘤細胞株U251應力纖維的形成的影響。通過免疫共沉淀、westemblot研究NRP-1單克隆抗體對膠質瘤細胞株U251作用后粘附于FN因子上相關蛋白含量的變化。
　　 實驗結果:
　　 結果顯示，我們制備的抗NRP-1抗體純化后純度高達95％，濃度為4mg/ml。Western Blot實驗顯示抗體能特異識別膠質瘤U251細胞中的NRP-1蛋白;細胞免疫熒光染色顯

5、示NRP-1 MAb定位于膠質瘤U251細胞膜上。粘附實驗表明抗NRP-1抗體對膠質瘤U251具有粘附抑制的作用。通過共聚焦熒光顯微鏡、免疫共沉淀、western blot實驗發(fā)現，抗NRP-1抗體可以抑制粘附的膠質瘤U251細胞的應力纖維的形成，影響整合素α5β1與NRP-1復合物的形成，降低FAK、p130cas的磷酸化水平。
　　 結論:
　　 本實驗成功制備了高純度和高特異性的NRP-1 MAb;粘附實驗結果表明