泛素結(jié)合酶基因UbcH10調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的實驗研究.pdf

1、本研究擬通過觀察UbcH10在不同病理級別腦膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤細胞株中的確切表達情況,并通過敲減UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞株中的表達,研究UbcH10在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能角色。實驗共分為三個部分：第一部分,觀察UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA和蛋白表達水平以及與膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性；第二部分,觀察UbcH10在U251和SHG-44腦膠質(zhì)瘤細胞株中的mRNA和蛋白表達水平及其與膠質(zhì)瘤細胞細胞周期的關(guān)系；第三部分,通過RNA干

2、擾的方法敲減UbcH10的表達觀察其對U251膠質(zhì)瘤細胞株增殖、凋亡等細胞表型的影響。 第一部分 泛素結(jié)合酶基因UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達研究 目的：研究UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA剪切形式、mRNA和蛋白表達水平及其與膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性。 方法：根據(jù)UbcH10的cDNA序列設(shè)計相應引物,應用RT-PCR和直接測序的方法檢測UbcH10 mRNA的不同剪切形式在32例不同級別腦星形膠質(zhì)細胞

3、瘤和6例正常腦組織中的表達。應用實時熒光定量PCR檢測UbcH10 mRNA在上述組織標本中的相對表達水平,應用免疫組織化學染色檢測UbcH10在55例腦星形膠質(zhì)細胞瘤組織和7例正常腦組織中的蛋白表達水平,并檢測UbcH10蛋白與增殖抗原Ki-67表達的相關(guān)性,最后應用免疫熒光雙重染色技術(shù)獲取UbcH10蛋白的細胞定位信息。 結(jié)果：32例腦星形膠質(zhì)細胞瘤和6例正常腦組織mRNA反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增獲得450bp左右產(chǎn)物,經(jīng)直接

4、測序證實與UbcH10 splice vl序列一致(GenBankaccession nos.NM 007019)。實時熒光定量PCR結(jié)果提示UbcH10 mRNA表達水平在星形膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(44.33±55.32 vs 1.00±1.57;P=0.000)。并且,UbcH10 mRNA水平在高級別膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于低級別膠質(zhì)瘤,二者相比差異顯著(64.33±60.98 vs 8.36±8.

5、15;p=0.000)。相似地,免疫組織化學染色提示UbcH10蛋白在星形膠質(zhì)細胞瘤組織中表達明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(7.90±5.70％vs 0.0±0.0％；P=0.000),且高、低級別膠質(zhì)瘤之間差別顯著(10.53±5.79％vs 4.23±2.85％；P=0.000),UbcH10陽性細胞染色率與增殖抗原Ki-67蛋白表達呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(Spearman r=0.63,P<0.001)。雙重免疫熒光染色提示Ub

6、cH10蛋白與GFAP蛋白共定位于膠質(zhì)瘤細胞胞漿。 結(jié)論:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表達于所有被檢測的星形膠質(zhì)細胞瘤和正常腦組織中,但其在星形膠質(zhì)細胞瘤組織中的mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常腦組織,并和膠質(zhì)瘤病理級別以及增殖抗原Ki-67表達呈正相關(guān)性,提示UbcH10可能在星形膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展惡變過程中具有重要作用。 第二部分 UbcH10在U251,SHG-44膠質(zhì)瘤細胞株中的表達及其與細

7、胞周期的關(guān)系 目的：研究泛素結(jié)合酶UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞系U251和SHG-44中的mRNA、蛋白表達水平和細胞亞定位水平；研究UbcH10蛋白在不同細胞周期的表達及與細胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1的關(guān)系。 方法：應用RT-PCR、實時熒光定量PCR等方法檢測UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞系U251和SHG-44中的mRNA剪切形式和表達水平,應用細胞免疫組化、蛋白印跡等方法研究UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞系中的

8、蛋白表達水平,應用免疫熒光染色檢測UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞中的細胞亞定位水平及其與Ki67蛋白的定位關(guān)系。采用無血清饑餓、胸腺嘧啶阻斷和Nocodazole等方法分別同步化細胞于G0、G1/S和G2/M期,應用蛋白印跡實驗檢測UbcH10在上述不同細胞周期的表達情況及其與細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A、Cyclin B1的相互關(guān)系。 結(jié)果：經(jīng)過PCR擴增和直接測序發(fā)現(xiàn)UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞系中的mRNA剪切形式為splice

9、 vl(GenBank accession nos.NM 007019)。熒光定量RT-PCR結(jié)果提示UbcH10 mRNA表達水平在膠質(zhì)瘤細胞系U251和SHG-44中明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(33.77±21.54,30.20±20.13 vs 1.00±1.57;P=0.000)。免疫組織化學染色和免疫熒光染色提示UbcH10蛋白主要表達于膠質(zhì)瘤細胞胞漿,并且部分表達UbcH10細胞亦表達增殖抗原Ki67,蛋白印跡實驗證

10、實其在U251和SHG-44細胞系中的表達水平明顯高于正常腦組織(0.40±0.23 vs 0.0±0.0;P<0.05)。UbcH10主要表達于G2/M期,在G0,G1/S期表達甚少。自雙胸腺嘧啶阻斷釋放后,UbcH10的表達逐漸升高,在G2/M期達到高峰,并與細胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1呈消長關(guān)系；自Nocodazole阻斷釋放后,UbcH10表達逐漸下降,細胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1表達亦逐漸下

11、降。 結(jié)論:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表達于所有被檢測的星形膠質(zhì)瘤細胞系中,其mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常腦組織,UbcH10在膠質(zhì)瘤細胞系中的表達與細胞周期密切相關(guān),在G2/M期達到峰值。 第三部分 靶向UbcH10的RNA干擾對U251膠質(zhì)瘤細胞株增殖、凋亡和細胞周期改變的作用 目的：研究靶向UbcH10的RNA干擾對U251膠質(zhì)瘤細胞株增殖、凋亡的作用。 方法：設(shè)計并合

12、成靶向UbcH10的siRNA,脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染U251細胞株,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。MTT法測定轉(zhuǎn)染后24、48、72和96-小時U251細胞增殖率,Annexin/PI雙染測定干擾后24、48和72小時早期凋亡細胞比例和細胞周期改變,TUNEL原位檢測UbcH10 siRNA 48h后凋亡細胞比例,蛋白印跡實驗測定轉(zhuǎn)染后48小時CyclinA、Cyctin B1、PCNA、Bax、Bcl-2、P53等蛋白表達水平變化。 結(jié)果:Ubc

13、H10 siRNA可有效敲減U251細胞UbcH10的表達。MTT法檢測UbcH10siRNA轉(zhuǎn)染組24,48,72和96小時的細胞生長吸光值分別為0.060±0.009,0.082±0.010,0.139±0.028,0.235±0.045;較陰性對照組(0.115±0.026,0.217±0.038,0.381±0.040,0.646±0.077)和未轉(zhuǎn)染組(0.101±0.017,0.215±0.048,0.390±0.047,0

14、.747±0.126)降低；其中24、48、72和96小時細胞生長與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)流式細胞儀檢測,24,48,72小時靶向siRNA轉(zhuǎn)染引起U251膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率分別為22.70±8.83％,12.37±2.14％和5.97±1.20％,陰性對照組為8.00±1.67％,4.63±1.45％和5.77±1.34％,未轉(zhuǎn)染組為4.07±1.06％,4.60±1.01％和4.27±0.90％。在24、

15、48d,時,早期凋亡比例均高于對照組和未轉(zhuǎn)染組,兩者之間差異顯著(P<0.05)。靶向UbcH10 siRNA轉(zhuǎn)染U251細胞484,時后G2/M期細胞比例顯著升高,較陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組差異顯著(37.53±2.04％vs 18.01±1.60％,18.62±0.69％;P<0.05)。TUNEL檢測結(jié)果顯示,在UbcH10 siRNA轉(zhuǎn)染組中,有散在分布的陽性染色細胞,其比例明顯高于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組(26.75±7.56％vs

16、7.64±3.75％,4.33±2.10％,P<0.05)。敲減UbcH10的表達后,Cyclin A的表達在干擾后出現(xiàn)升高,與對照組相比差異顯著；Cyclin B1的表達在干擾后亦出現(xiàn)升高趨勢；PCNA的表達在干擾后即下降,并且持續(xù)至干擾后72d,時,與對照組相比差異顯著；Bax的表達在干擾后出現(xiàn)升高,Bcl-2的表達在干擾后24至48d,時出現(xiàn)降低,與對照組相比差異顯著；P53的表達在干擾后出現(xiàn)升高,與對照組相比差異顯著,p-P53

17、的表達在干擾后亦出現(xiàn)升高趨勢,48和72d,時與對照組相比差異顯著。然而,Akt、p-Akt、P38、p-P38、c-Jun和P-c-Jun等蛋白表達水平無明顯改變。 結(jié)論：通過RNA干擾敲減UbcH10在U251膠質(zhì)瘤細胞中的表達可有效抑制腫瘤細胞的增殖,其可能原因是通過減少cyclin A和cyclin B1的降解,由此導致細胞周期的阻滯；敲減UbcH10表達可促進P53、Bax蛋白的表達,并抑制Bel-2的表達,由此促進膠