RhoA-Rho激酶信號通路在高糖誘導大鼠心肌細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:糖尿病性心肌病(DC)，是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為心室舒張功能受損，最終發(fā)展為心力衰竭，這與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。心肌細胞凋亡在DC的形成中起著重要作用，是DC主要的病理特征之一。因此，更好地了解高血糖狀態(tài)下心肌細胞凋亡的發(fā)病機制，為DC的防治提供新的策略是非常必要的。RhoA/Rho激酶(ROCK)信號通路有著“分子開關(guān)”的作用，調(diào)節(jié)著細胞的收縮、粘附、增殖和凋亡等多種生物學行為和功能。有研究

2、表明在心肌缺血再灌注損傷中，ROCK介導了心肌細胞凋亡。本研究通過觀察體外高糖條件下心肌細胞的凋亡情況并應(yīng)用ROCK特異性抑制劑法舒地爾進行干預，探討RhoA/ROCK通路在誘導心肌細胞凋亡中的作用，旨在為DC提供一個新的治療靶點。
　　方法:取出生后1-3天的SD大鼠，組織消化法進行心肌細胞體外培養(yǎng)，臺盼藍染色法進行心肌細胞活力鑒定，采用細胞免疫化學法進行心肌細胞鑒定。將心肌細胞分為9組:正常對照組（NG:含5.5mmol/L葡

3、萄糖）、高糖組（HG:含25mmol/L葡萄糖）、高滲透壓組（OSM:5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、正常糖濃度+法舒地爾組（50、75和100μmol/L）、高糖濃度+法舒地爾組（50、75和100μmol/L），培養(yǎng)72小時。采用流式細胞術(shù)檢測心肌細胞的凋亡率并分析細胞周期，應(yīng)用Westernblotting檢測磷酸化MYPT1水平、Bax/Bcl-2、caspase3蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　

4、1、高糖和法舒地爾對心肌細胞凋亡的影響:從流式結(jié)果分析，與對照組相比，高糖組心肌細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01）;與高糖組比較，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);當高糖中加入法舒地爾100μmol/L時，凋亡率與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾(50、75和

5、100μmol/L）與對照組相比細胞凋亡率無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2、高糖和法舒地爾對心肌細胞周期的影響:從細胞周期結(jié)果分析，與對照組相比，高糖組心肌細胞處于G0期細胞數(shù)量顯著升高(P＜0.01);與高糖組相比，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，G0期細胞數(shù)量顯著下降(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/

6、L）與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。高糖組G2期細胞數(shù)量較對照組顯著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，G2期細胞數(shù)量較高糖組顯著升高(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);當法舒地爾濃度為100μmol/L時，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。高糖組S期細胞數(shù)量較對照組顯著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，

7、S期細胞數(shù)量較高糖組顯著升高(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);當法舒地爾濃度為100μmol/L時，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）時G2期、S期細胞數(shù)量與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3、高糖和法舒地爾對ROCK活性的影響:肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1(MYPT1)是ROCK

8、的主要底物之一，磷酸化的MYPT1是ROCK信號通路激活的標志，因此檢測磷酸化MYPT1水平來反應(yīng)ROCK的活性。與對照組相比，高糖組磷酸化MYPT1水平顯著升高(P＜0.01)。與高糖組相比，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）顯著抑制了磷酸化MYPT1水平的增加(P＜0.01);且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);高滲透壓組及正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）與對照組相比無顯著性差

9、異(P＞0.05)。
　　4、高糖和法舒地爾對Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達的影響:各組Bcl-2表達無明顯差異(P＞0.05);與對照組相比，高糖組Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達顯著升高(P＜0.01);在高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L），Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達較高糖組顯著下降(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。當高糖

10、中加入法舒地爾100μmol/L時與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）與對照組相比，Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能夠誘導心肌細胞凋亡并將細胞周期阻滯于G0期;
　　2、高糖通過激活RhoA/ROCK信號通路，上調(diào)Bax和casepase3表達從而介導了心肌細胞凋亡;ROC