結直腸癌中EphB2的表達及其下調機制研究.pdf

1、EPHB2基因編碼的蛋白EphB2是受體酪氨酸激酶家族的一員，表達于細胞膜，與相鄰細胞表面的配體結合介導雙向信號轉導，在膜蛋白酶水解作用或內吞作用下受體、配體之間的結合被破壞，從而導致細胞間的排斥。早期研究發(fā)現(xiàn)EphB2在人類多數(shù)腫瘤(包括結直腸癌)中存在表達上調，能通過提升細胞遷移能力和促進血管生成，參與腫瘤的形成和發(fā)展。但新近研究卻發(fā)現(xiàn)EphB2在結直腸腺瘤-癌過渡時期存在不同程度的表達下調，它與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，主要通

2、過與其配體結合介導細胞間排斥(區(qū)室化)抑制結直腸上皮細胞癌變及進展。 結直腸癌中EphB2表達下調的原因還不清楚。目前，僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)結直腸癌中存在EPHB2基因的突變、雜合性丟失等遺傳學改變。而關于表觀遺傳學改變也存在一定爭議。因此有必要對結直腸癌中EphB2的表達和調控進行進一步的研究。 在本研究中，我們采用Western印跡法檢測了4株結腸癌細胞EphB2的表達，采用免疫組織化學和Real-timePCR技術檢測了1

3、3例正常人直腸粘膜組織、30例結直腸癌及癌旁正常腸粘膜組織中EphB2蛋白和mRNA表達水平，證實結直腸癌中EphB2的表達存在不同程度的下調，其表達水平與腫瘤分化程度有關(P＜0.05)，分化越差，表達越低。采用甲基化特異性PCR技術檢測了上述細胞和標本中EPHB2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)無一例存在甲基化。同時采用亞硫酸氫鹽修飾后基因組測序技術在所有細胞和其中17例EphB2缺失表達的結直腸癌組織中驗證了以上結果。

4、 由于轉錄調控是基因表達調節(jié)的重要環(huán)節(jié)，目前關于EPHB2這方面的研究報道較少。我們首先采用報告基因和熒光素酶檢測系統(tǒng)對EPHB2基因啟動子進行克隆、鑒定，確定核心啟動子位于-425～+83區(qū)域內，并發(fā)現(xiàn)-1174～970區(qū)域存在沉默子。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這兩個區(qū)域分別存在轉錄因子Spl的結合位點之一GC盒和轉錄因子c-Rel的結合位點。我們對這兩個位點進行突變后發(fā)現(xiàn)，GC盒突變后啟動子活性較突變前降低了15％左右(P＞0.05)；

5、c-Rel結合位點突變后啟動子活性較突變前升高了85％左右(P＜0.01)。 綜上所述，結直腸癌中EphB2的表達無論在蛋白還是mRNA水平均存在不同程度的下調，其原因與基因啟動子區(qū)CpG島甲基化無關，而與轉錄調控有關。在結直腸癌中，可能是轉錄因子c-Rel活化后與沉默子結合，從而抑制了EPHB2基因的轉錄表達。以上的研究結果為闡明結直腸癌中EphB2表達下調機制提供了新的線索，也有希望為結直腸癌的基因和藥物治療提供新的靶點。