NDRG2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能和作用機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)在世界范圍內(nèi)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前對(duì)CRC的主要治療手段是通過(guò)外科手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，并且輔以新輔助化療、輔助化療和放射治療。盡管近年來(lái)醫(yī)學(xué)界在CRC的早期診斷、根治術(shù)式、放射治療和輔助化療方面取得了一定的進(jìn)展，但CRC的發(fā)病率和死亡率在近二十年來(lái)仍呈逐年上升的趨勢(shì)，而且TNM分期Ⅲ期和IV期的CRC病例的術(shù)后五年生存率仍較低。在CRC導(dǎo)致死亡的病例中，腫瘤進(jìn)展導(dǎo)致的侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)

2、后復(fù)發(fā)是致死的主要原因。因此，明確CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)CRC的預(yù)后診斷、個(gè)體化治療以及靶向治療具有重要的理論和實(shí)際意義。N-myc downstream-regulated gene（NDRG）家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個(gè)具備57％-65％氨基酸同源性的成員組成。其中的NDRG2基因是由我校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室首先克隆得到并報(bào)道的新基因。前期的研究發(fā)現(xiàn)NDRG2作為癌基因Myc的下游調(diào)節(jié)基因，在多

3、種人類(lèi)惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中呈低表達(dá)，說(shuō)明該基因極其有可能作為一個(gè)重要的抑癌基因參與腫瘤惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。但是NDRG2在CRC中的表達(dá)模式、具體的細(xì)胞水平和分子水平功能以及相關(guān)的作用機(jī)制迄今為止仍未闡明。
　　本研究為了闡明以上問(wèn)題：
　　1．首先利用RT-PCR初步檢測(cè)了30例隨機(jī)選取的臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中的NDRG2mRNA表達(dá)水平。
　　2．使用R

4、ealtime PCR檢測(cè)了226例臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中的NDRG2mRNA表達(dá)水平，并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析NDRG2mRNA表達(dá)與臨床病理資料以及病例預(yù)后的關(guān)系。
　　3．使用western blot檢測(cè)了86例隨機(jī)選取的臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中的NDRG2蛋白表達(dá)水平。
　　4．使用西京醫(yī)院收集的260例臨床CRC標(biāo)本和天津市人民醫(yī)院收集的681例臨床CRC標(biāo)本制成組織芯片，并收集詳細(xì)的臨床病理資料和預(yù)后隨

5、訪(fǎng)資料。對(duì)組織芯片進(jìn)行NDRG2免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判讀，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析大樣本中NDRG2蛋白表達(dá)與臨床病理資料和病例預(yù)后的關(guān)系。
　　5．使用脂質(zhì)體分別將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞內(nèi)，使用Realtime PCR鑒定NDRG2mRNA水平的表達(dá)改變，使用western blot檢測(cè)NDRG2蛋白水平的表達(dá)改變。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為pcDNA3.1-NDRG2組、siRNA-NDRG2

6、組、空白對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞）和空載體對(duì)照組（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的SW620細(xì)胞）。使用MTT比色法和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的周期和凋亡，使用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，使用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　6．使用免疫組織化學(xué)染色方法分析CRC組織芯片中NF-κB通路主要信號(hào)分子p65的表達(dá)情況，并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析臨床標(biāo)本中NDR

7、G2與p65表達(dá)之間的關(guān)系。使用Realtime PCR和western blot方法檢測(cè)SW620細(xì)胞分別染入pcDNA3.1-NDRG2、siRNA-NDRG2后p65的表達(dá)情況。
　　以上的研究發(fā)現(xiàn)：
　　1．在使用RT-PCR檢測(cè)的30例臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中，有12例CRC的NDRG2mRNA表達(dá)量較配對(duì)正常組織相比降低50％以上，說(shuō)明NDRG2mRNA表達(dá)水平在CRC中有降低的趨勢(shì)。
　　2．使用R

8、ealtimePCR檢測(cè)的所有226例臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NDRG2mRNA的表達(dá)水平在CRC組織中明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。而且NDRG2mRNA的表達(dá)水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。
　　3．在使用western blot檢測(cè)的86例臨床CRC組織和配對(duì)正常組織中，有52例CRC的NDRG2蛋白表達(dá)水平明顯低于配對(duì)正常組織，趨勢(shì)與

9、mRNA水平檢測(cè)結(jié)果一致。
　　4．在使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)的組織芯片中，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CRC標(biāo)本中的NDRG2蛋白表達(dá)水平與配對(duì)正常組織相比明顯降低（P＜0.001）。而且NDRG2蛋白表達(dá)水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)NDRG2蛋白表達(dá)水平可以作為CRC的獨(dú)立預(yù)后影響因素。
　　5．Realtime PCR和western blot證實(shí)了

10、將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞后，NDRG2mRNA和蛋白水平會(huì)分別升高和降低。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞生長(zhǎng)則受到明顯抑制。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增加而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞克隆形成數(shù)量則明顯減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-NDRG2組

11、細(xì)胞發(fā)生了明顯的G1期阻滯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞凋亡明顯減少而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞凋亡則明顯增加。transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞侵襲能力則明顯減弱。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯增強(qiáng)而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯下

12、降。
　　6．免疫組織化學(xué)染色方法分析CRC組織芯片中NDRG2和NF-κB通路主要信號(hào)分子p65的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)NDRG2與p65的蛋白表達(dá)水平在臨床CRC標(biāo)本中呈負(fù)相關(guān)。RealtimePCR和westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NDRG2后p65的表達(dá)水平降低，而轉(zhuǎn)入siRNA-NDRG2后SW620細(xì)胞中p65的表達(dá)則上升。
　　以上的研究結(jié)果證明NDRG2的表達(dá)水平在CRC中呈下調(diào)表