系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中泌乳素介導的JAK-STAT信號通路及AG490的干預研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種女性多見、臨床表現(xiàn)多樣、可累及全身多臟器的自身免疫性疾病。免疫調節(jié)異常在SLE的發(fā)病中起主導作用，其中包括許多免疫細胞的功能異常。近年來世界范圍內報道SLE的發(fā)病率在（13～39）110萬之間，18歲以上女性發(fā)病率高達372/10萬。我國患病率約為70/10萬，且有逐年增多的趨勢。其發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關。

2、泌乳素（Prolactin，PRL）是一種主要由垂體前葉的嗜酸細胞分泌的、具有300多種獨立活性的多肽。它參與了機體多個生理和疾病過程，如炎癥反應、自身免疫性疾病、滲透壓調節(jié)等。其經(jīng)典作用是調節(jié)哺乳動物乳腺、卵巢及男性附屬生殖器官的生長和分化過程，促進泌乳。它的具體作用包括：①參與T細胞分化，調節(jié)TH1/TH2平衡向TH1方向偏移；②活化蛋白激酶C和鳥氨酸環(huán)化酶；③具有促有絲分裂原的作用，誘導淋巴細胞的IL-12受體表達和各種生長因子相

3、關基因的表達；④通過干擾素調節(jié)因子促進干擾素γ的表達；⑤刺激自身抗體的產(chǎn)生。 AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈脂類衍生物，相對分子質量為294．3，結構類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結合位置，而競爭性抑制細胞內JAK的活性，從而抑制其下游的信號分子STAT5的表達，進而抑制與該通路有關的各種炎癥因子的產(chǎn)生。本研究擬通過AG490對PRL誘導的胞內JAK/STAT5信號通路干預的研究，進一步明確SLE的發(fā)病機制，以期

4、為SLE的生物治療開辟一條新的治療途徑。 目的: 1．檢測SLE患者血清PRL水平，分析其與SLE疾病活動性、臨床表現(xiàn)及實驗室指標的關系。 2．研究PRL（內源性）及重組人PRL（rhPRL）對SLE患者PBMC內主要信號蛋白STAT5表達的影響，探討其參與SLE發(fā)病的機制。 3．研究PRL及thPRL對SLE患者PBMC分泌IL-6的影響，從而探討PRL介導的胞內信號傳導通路JAK/STAT5與IL-6

5、產(chǎn)生的關系。 4．通過AG490對JAK/STAT5信號傳導通路的干預研究，明確SLE中PRL誘導PBMC分泌IL-6的作用機制，以期為SLE的生物治療開辟一條新的治療途徑。 方法: 1．應用電化學發(fā)光儀檢測了40例SLE患者（其中女性36例，男性4例）及20例健康人在清晨、空腹及靜息狀態(tài)下的血清PRL水平。取空腹靜脈血3ml，血清泌乳素的檢測采用電化學發(fā)光儀測定。按試劑盒提供標準，血清PRL水平男性>15．2n

6、g/ml，女性>23．3ng/ml定為HPRL。 2．將樣本分組：40例SLE患者中，HPRL的SLE患者為22例，PRL正常的SLE患者18例，又將其按不同的處理方式各自再分為3組，加上健康對照組一共為7組。分組如下：①HPRL的SLE患者組（N=22）；②HPRL的SLE患者+AG490組（N=22）；③HPRL的SLE患者+AG490+rhPRL組（N=22）；④正常對照+rhPRL組（N=20）；⑤正常PRL的SLE患者

7、組（N=18）；⑥正常PRL的SLE患者+rhPRL組（N=18）；⑦正常PRL的SLE患者+rhPRL+AG490組（N=18）。取六孔板，將細胞和培養(yǎng)液鋪于六孔板中，使每孔細胞數(shù)量達到1×106/ml。thPRL的最終濃度為10ng/ml，AG490的最終濃度為10-6mol/l。 3．PBMC分離、培養(yǎng)：按密度梯度離心法分離外周血中的PBMC，步驟如下： （1）在15ml有刻度無菌離心管中，每管加入5mlFicol

8、l淋巴細胞分離液，然后取肝素抗凝的外周靜脈血10ml（包括40例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和20例正常對照女性）與等量PBS充分混勻稀釋。用巴斯德滴管吸取已稀釋的抗凝血10ml沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液上（每樣本按2管分離），20℃，2000rpm，水平離心20min。（2）用滴管插到灰白色層，吸取單個核細胞，置于另一離心管內。加入5倍以上體積的PBS，20℃，1500rpm，水平離心10min，洗滌細胞2次，獲得研究樣品的PBMC。（3）

9、處理后的每組細胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h后分別進行ELISA檢測和Western blot檢測。 4．ELISA檢測：將培養(yǎng)后的細胞1500rpm，水平離心10min，取上清按IL-6 ELISA試劑盒提供的步驟操作。操作程序總結如下：①加樣品和標準品，37℃反應90min。不洗。②加生物素標記抗體，37℃反應60min。0．01M TBS洗滌3次。③加ABC，37℃反應30min。0．01M TBS洗滌5次。④

10、TMB37℃反應10-15min。⑤加入TMB終止液，用酶標儀450nm讀數(shù)。 5．Western blot檢測：將離心沉積的細胞用預冷的PBS洗滌3次，加入預冷的細胞裂解液RIPA20μl及PMSF5ul，置0℃裂解10min后吸入EP管中，超聲粉碎細胞，4℃離心（1，000×g，30min）。取上清提取總蛋白。待測樣品采用BCA比色法進行蛋白定量。按常規(guī)方法配制10%SDS-PAGE分離膠和5%積層膠。細胞樣品加入到上樣緩沖

11、液中，在沸水中煮10分鐘。然后每孔加入50μg細胞蛋白樣品，置電泳緩沖液中，80v電泳約30 min。待樣品進入分離膠后，140v電泳至溴酚藍指示劑離膠底線約1cm時停止電泳。10v半干式電轉膜25min，將蛋白質轉移至PVDF膜上。TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2小時后加入一抗1：1000，37℃孵育1小時或4℃過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗1：500，37℃孵育1小時。洗膜后加發(fā)光劑顯影，定影，洗片。用凝膠成像分析系統(tǒng)

12、進行灰度掃描，結果以STAT5/β-actin、p-STAT5/β-actin的灰度比值表示。 6．統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)輸入SPSS13．0軟件包，兩組樣本均數(shù)之間的比較使用兩獨立樣本t檢驗。多組樣本均數(shù)之間的比較，當滿足方差齊性時，使用單向方差分析和樣本均數(shù)間的多重比較（LSD方法）。當不滿足方差齊性時使用近似F檢驗（Welch方法）及校正的多重比較方法（Dunnett's T3）。多個樣本率的比較使用X2檢驗。雙變量間的關系

13、使用雙變量相關分析及多變量間的關系使用曲線估計。使用Curve Expert1．3繪制擬合曲線并根據(jù)曲線擬合的決定系數(shù)R2選擇最佳曲線擬合方程。以P<0．05視為有統(tǒng)計學意義，結果中數(shù)據(jù)以x±SD表示。 結果: 1．SLE患者血清平均PRL水平顯著高于正常對照組（t=3．783，P=0．000），且活動期更為明顯（F=17．812，P=0．000）。SLE患者血清PRL水平與SLEDAI呈正相關（r=0．568，P=0．

14、000）。 2．HPRL的SLE患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如頭痛、癲癇發(fā)作、腎損害、抗ds-DNA抗體陽性、皮疹及口腔潰瘍的發(fā)生率顯著高于血清PRL正常者（P<0．05），而補體C3、C4下降、發(fā)熱、血液系統(tǒng)受累及漿膜炎等的發(fā)生率則無明顯差異。 3．①HPRL的SLE患者組PBMC分泌IL-6、總STAT5表達水平及STAT5磷酸化（p-STAT5）程度均顯著高于正常PRL的SLE患者組和正常對照組（P<0．05）。

15、②HPRL的SLE患者組PBMC加入AG490培養(yǎng)后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達均較前顯著降低（P<0．05）。 ③HPRL的SLE患者組PBMC加入thPRL和AG490共同培養(yǎng)后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達較前均顯著降低（P<0．05）。同時發(fā)現(xiàn)HPRL的SLE患者組PBMC加thPRL和AG490共同培養(yǎng)后IL-6及STAT5表達水平較單獨加用AG490時有所增加（P=0．000）。

16、 4．①PRL正常的SLE患者組PBMC經(jīng)rhPRL刺激后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達水平較前顯著增加（P<0．05）。 ②與正常對照組相比，經(jīng)rhPRL刺激后，PRL正常的SLE患者IL-6、總STAT5的表達水平明顯增加（P=0．000），但p-STAT5表達水平無明顯差異（P=0．135）。 ③PRL正常的SLE患者組加入thPRL和AG490前后，IL-6及總STAT5表達水平差異有統(tǒng)計學意

17、義（P<0．05），但p-STAT5水平無明顯改變（P=0．067）。 結論: 1．SLE患者血清PRL增高與其病情活動明顯相關，可作為判定SLE疾病活動的指標之一。 2．無論是外源性還是內源性PRL均可上調SLE患者PBMC內總STAT5、p-STAT5和IL-6的表達水平，AG490能明顯抑制這種調節(jié)作用。 3．AG490可通過下調總STAT5及p-STAT5的表達水平，而對內源性、外源性PRL誘導的