外周血基質(zhì)干細胞培養(yǎng)鑒定及其向施萬細胞的誘導分化.pdf

1、近年來,干細胞移植已經(jīng)被認為足修復神經(jīng)損傷最具應用前景的治療策略之一。該領域被廣泛研究和關注的干細胞主要有胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓基質(zhì)干細胞和臍帶血基質(zhì)干細胞等。除了骨髓基質(zhì)干細胞外,目前其它類型干細胞大多需要從異體獲取,它們在運用過程存在較嚴重的道德倫理和免疫排斥等問題。而骨髓基質(zhì)干細胞在取材過程對患者本身帶來較大的痛苦。所以,有必要研究及尋求更好的干細胞來源。
　　 大量研究已經(jīng)證實臍帶血干細胞與骨髓基質(zhì)干細胞的表型非常

2、相似,也都具有高度的增殖和分化潛能。從發(fā)育生物學來看,臍帶血實質(zhì)上就是胎兒血。這也就說明,直到出生時人體血液中還存在大量的具有高度增殖和分化潛能的干細胞。鑒于此,本研究擬探討成體外周血中是否還存在這些干細胞,并建立分離培養(yǎng)外周血基質(zhì)干細胞(Peripheral blood derived mesenchymal stemcells,PBMSCs)的方法。
　　 由于施萬細胞具有分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子,引導和促進神經(jīng)再生的功能,它常

3、常被應用于修復中樞和周圍神經(jīng)損傷。但是傳統(tǒng)從外周神經(jīng)分離培養(yǎng)施萬細胞的方法明顯限制了施萬細胞的來源,近年來許多研究者均采取定向誘導的方法從干細胞分化獲得施萬細胞。所以,本研究在獲得外周血基質(zhì)干細胞的基礎上,探討將其在體內(nèi)外誘導成定向誘導為施萬細胞的方法,為進一步將其用于修復神經(jīng)損傷打下基礎。
　　 本研究分為三個部分。
　　 第一部分:PBMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 從SD大鼠取血分離培養(yǎng)PBMSCs,采用

4、流式細胞術和免疫細胞化學法對其細胞表面抗原進行檢測與鑒定,流式細胞術顯示培養(yǎng)獲得的PBMSCs中CD29、CD90、CD45、CD11b、CD106及CD49d的陽性率分別為99.96％、71.22％、46.62％、19.97％、10.76％和5.46％。免疫細胞化學法顯示PBMSCs呈CD44和CD106陽性,CD34陰性。并用免疫細胞化學法檢測BrdU作用4h后BrdU的陽性率。第2代PBMSCs BrdU陽性率為(34.1±4.3

5、)％。以上結果顯示外周血分離獲得的干細胞具有基質(zhì)干細胞的特性。
　　 第二部分:PBMSCs在體外誘導分化成為施萬細胞
　　 PBMSCs經(jīng)β-巰基乙醇、傘反式維甲酸及復合條件培養(yǎng)基(1％N2、50ng/mlheregulin、5 μ M forskolin、10ng/ml bFGF及5ng/ml PDGF)等三個步驟向施萬細胞定向誘導后,用免疫細胞化學法檢測S-100和P75的表達。結果顯示S-100和P75的陽性率分

6、別是(75.2±4.1)％和(78.9±4.6)％。表明PBMSCs在特定的條件下可定向分化成為施萬細胞。
　　 第三部分:PBMSCs在損傷坐骨神經(jīng)內(nèi)分化成為施萬細胞
　　 制作大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型后向損傷處移植GFP陽性PBMSCs。術后1w、2w、6w時取材、切片并進行進行形態(tài)學觀察。結果發(fā)現(xiàn),移植的PBMSCs在坐骨神經(jīng)內(nèi)能分化成為施萬細胞樣細胞,大量GFP陽性移植細胞表達施萬細胞的標志蛋白S-100和P75。另