表達結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合抗原與IL-21核酸疫苗構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、結(jié)核病（TB）是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）引起的慢性傳染病，仍然是威脅人類健康的三大感染性疾病之一。目前全世界大約有20億人被MTB感染，每年超過200萬人死于結(jié)核病。盡管在全球范圍內(nèi)進行了大規(guī)?？ń槊缃臃N以預(yù)防結(jié)核病，然而隨著人口流動的增加、多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)、結(jié)核分枝桿菌合并HIV病毒感染以及卡介苗接種防護的自身局限性等原因，自20世紀以來，結(jié)核病的發(fā)生率在全球呈明顯的上升趨勢。 傳統(tǒng)的結(jié)核病疫苗是卡介苗（BCG），雖然可

2、有效預(yù)防兒童結(jié)核病尤其是結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生，但對成人結(jié)核病的預(yù)防作用甚微，對免疫功能低下或免疫缺陷患者使用卡介苗則可引起嚴重的散播性結(jié)核病，其對人體的保護效力在0％～80％之間。鑒于卡介苗本身的局限性，研究和開發(fā)一種更有效、安全、適合各類人群使用的新型結(jié)核病疫苗勢在必行。 實驗室在前期的研究中成功構(gòu)建了結(jié)核菌Ag85A與IL-21共表達核酸疫苗，實驗證明共表達核酸疫苗免疫組小鼠的CTL活性明顯增強、特異性淋巴細胞明顯增殖、NK細

3、胞殺傷活性與對照組相比有一定提高。在此基礎(chǔ)上，我們用真核表達質(zhì)粒pIRES作為載體，構(gòu)建Ag85A-ESAT-6融合基因與IL-21共表達核酸疫苗，研究其誘導小鼠的免疫效應(yīng)，為下一步該核酸疫苗抗結(jié)核桿菌感染的研究奠定基礎(chǔ)。本實驗分為兩個部分： 一、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達核酸疫苗的構(gòu)建及體外表達的鑒定 目的：利用真核表達質(zhì)粒pIRES，構(gòu)建結(jié)核桿菌Ag85A、ESAT-6融合基因與細胞因

4、子IL-21共表達核酸疫苗pIRES-IL21-Ag85A-ESAT-6，并在骨髓瘤細胞（SP2/O）中表達。方法：先用PCR方法從本室保存的重組質(zhì)粒pIRES-Ag85A中擴增出Ag85A基因序列并插入到質(zhì)粒pIRES-ESAT-6上成為plRES-Ag85A-ESAT-6，再用PCR方法從pRSC-IL-21重組質(zhì)粒中擴增出IL-21基因，構(gòu)建于pIRES-Ag85A-ESAT-6重組質(zhì)粒上，成為共表達核酸疫苗pIRES-IL21-

5、Ag85A-ESAT-6。結(jié)果：經(jīng)酶切、基因測序、RT-PCR證實重組核酸疫苗構(gòu)建正確并能成功表達目的基因。結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達核酸疫苗，為進一步研究其免疫效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 二、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達核酸疫苗誘導C57BL/6小鼠免疫應(yīng)答的初步研究 目的：研究結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達核酸疫苗類似物對

6、小鼠免疫功能的影響。方法：將100μg重組質(zhì)粒免疫小鼠，共三次，每次間隔兩周，總共300μg/只鼠。通過NK細胞活性、脾細胞細胞毒作用、脾細胞增殖試驗、以及小鼠血清抗體、IFN-γ和IL-4水平的檢測，評價結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達核酸疫苗的免疫效果。結(jié)果：pLRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗免疫鼠的NK細胞活性、脾細胞細胞毒作用、脾細胞增殖反應(yīng)及IFN-γ水平明顯高于對照組，差異有顯