Mdr1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2-mdr1的篩選.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellarcancinoma，HCC)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已占所有惡性腫瘤5％以上，全球每年死于肝癌的病人超過(guò)500萬(wàn)人。在我國(guó)肝癌已成為惡性腫瘤的第二大病因，每年死于肝癌的病人列全球第一位。根治性手術(shù)治療是肝癌治療的首選方法，但臨床上適合于根治性治療的患者只占全部肝癌患者的30％～40％，因此，化療是是當(dāng)今肝癌治療的重要方法之一。在腫瘤化療過(guò)程中，多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR

2、)的產(chǎn)生一直是影響其療效的首要因素，是腫瘤化療急需解決的難題和研究的熱點(diǎn)。 多藥耐藥細(xì)胞株是研究MDR現(xiàn)象的主要工具之一，目前建立多藥耐藥細(xì)胞系的方法主要是在體外用抗癌藥物逐漸誘導(dǎo)的方法。但此方法建立的MDR細(xì)胞系，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，誘導(dǎo)后細(xì)胞的生物特性和敏感性發(fā)生差異，當(dāng)處于無(wú)化療藥物培養(yǎng)時(shí)，穩(wěn)定性較差，耐藥性往往發(fā)生丟失。另外，由該方法建立的細(xì)胞株產(chǎn)生MDR的機(jī)制復(fù)雜，至少有Pgp和MRP等兩種機(jī)制參與，這不利于對(duì)MDR現(xiàn)象中單一

3、機(jī)制和逆轉(zhuǎn)的研究，尤其是目前比較熱門(mén)的利用反義寡核苷酸、核酶及RNA干擾等基因方法逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌抗藥表型的研究。因此，通過(guò)生物轉(zhuǎn)基因方法建立MDR細(xì)胞系，其生物特性和敏感性相同，MDR的機(jī)制單一，當(dāng)處于無(wú)化療藥物培養(yǎng)時(shí)，穩(wěn)定性較好，不會(huì)發(fā)生耐藥性丟失，將克服上述細(xì)胞模型的缺點(diǎn)。目前，利用該方法建立的MDR細(xì)胞系在膀胱癌、鱗狀細(xì)胞癌等已有報(bào)道，但在肝癌中，迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，我們?cè)O(shè)想通過(guò)基因?qū)氲姆椒ǎ瑢DR基因克隆到肝癌

4、細(xì)胞株，使其表達(dá)有功能的多藥耐藥蛋白，產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，從而建立一系列肝癌MDR細(xì)胞系，將為深入其MDR提供理想的細(xì)胞模型。 目的①構(gòu)建多藥耐藥基因(mdr1)真核表達(dá)載體PCI-neo-mdr1，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，篩選出人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株HepG2/mdr1細(xì)胞。②觀察HepG2/mdr1細(xì)胞生物學(xué)特性和體內(nèi)、外耐藥性及反義RNA對(duì)其耐藥性的逆轉(zhuǎn)，探討其耐藥機(jī)理，為深入研究肝癌的MDR及其逆轉(zhuǎn)提供理想的細(xì)胞模型

5、。③探索建立肝癌MDR細(xì)胞株的新方法，為肝癌MDR的研究提供技術(shù)平臺(tái)。 方法雙酶切攜帶有mdr1cDNA的質(zhì)粒PHAmdr1，獲取mdr1cDNA，亞克隆到真核表達(dá)載體PCI-neo的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCI-neo-mdr1；酶切鑒定后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)然HepG2細(xì)胞，G418篩選克隆陽(yáng)性細(xì)胞，阿霉素(Adruamycin,ADM)短暫誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)，篩選出肝癌多藥耐藥細(xì)胞株HepG2/mdr1細(xì)胞。提取HepG2/md

6、r1細(xì)胞的總DNA，PCR擴(kuò)增mdr1特異片斷以檢測(cè)mdr1基因的表達(dá)狀況；MTT法檢測(cè)HepG2/mdr1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及對(duì)ADM和絲裂霉素(Mitomycin,MMC)的半數(shù)致死量(IC50)，以觀察HepG2/mdr1細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和多藥耐藥性；RT-PCR檢測(cè)HepG2/mdr1細(xì)胞的mdr1mRNA及流式細(xì)胞儀(Flowcytometry,FCM)檢測(cè)其P-gp的表達(dá)和對(duì)柔紅霉素(Daunorubicin,DNR)的蓄積，以觀

7、察mdr1基因在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況及其表達(dá)產(chǎn)物P-gp的功能。觀察攜帶反義mdr1基因片段的重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1對(duì)HepG2/mdr1細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)，以探討HepG2/mdr1細(xì)胞MDR機(jī)理。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，以觀察HepG2/mdr1細(xì)胞的成瘤性和體內(nèi)耐藥性。 結(jié)果成功構(gòu)建了攜帶mdr1cDNA的重組真核表達(dá)載體PCI-neo-mdr1并能夠高效率的轉(zhuǎn)然HepG2細(xì)胞；PCR能夠在He

8、pG2/mdr1細(xì)胞中擴(kuò)增出而在其親代細(xì)胞HepG2細(xì)胞中并無(wú)mdr1特異性片斷，說(shuō)明重組真核表達(dá)載體PCI-neo-mdr1能夠成功地將mdr1cDNA導(dǎo)入HepG2細(xì)胞，而HepG2細(xì)胞本身不含目的基因mdr1cDNA；MTT的結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2/mdr1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，與其親代細(xì)胞HepG2細(xì)胞相比，并無(wú)明顯差異，而其對(duì)ADM和MMC的IC50分別為25ug/ml和10ug/ml，較其親代細(xì)胞HepG2細(xì)胞分別增加了35倍和125

9、倍，說(shuō)明mdr1的導(dǎo)入并沒(méi)有明顯影響宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，而是增加其MDR；HepG2/mdr1細(xì)胞mdr1mRNA和P-gp的表達(dá)均明顯增加，較其親代細(xì)胞HepG2細(xì)胞均增加了分別約2倍和3倍，而HepG2/mdr1細(xì)胞MRP的表達(dá)增加卻不明顯，差異性無(wú)顯著意義(P＞0.05)，P-gp的特異性底物DNR在HepG2/mdr1細(xì)胞中的蓄積明顯減少，差異性有顯著意義(P＜0.05)，說(shuō)明導(dǎo)入的mdr1基因在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá)有功能的P-g

10、p，從而增加其多藥耐藥性；在體外感染重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr148h后，HepG2/mdr1細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)化療藥物的敏感性，其對(duì)ADM的IC50和RF分別為3ug/ml和3.4，較未感染的HepG2/mdr1細(xì)胞對(duì)ADM的IC50和RF分別下降7.7倍和13.4倍。感染腺病毒48h后HepG2/mdr1細(xì)胞mdr1mRNA和P-gp的表達(dá)呈下降，對(duì)DNR的蓄積增加；與未感染的HepG2/mdr1細(xì)胞相比，差異性有顯著意

11、義(P＜0.05)，但較其親代細(xì)胞HepG2細(xì)胞差異性不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明攜帶反義mdr1基因片段的重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1幾乎能夠完全逆轉(zhuǎn)HepG2/mdr1細(xì)胞的耐藥性，結(jié)合本研究小組前期研究結(jié)果，重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1只能部分逆轉(zhuǎn)肝癌MDR細(xì)胞株SMMC7721/ADM的MDR，這也從另一方面證明了HepG2/mdr1細(xì)胞的耐藥機(jī)理明確、單一，有利于對(duì)肝癌MDR的研究，較體外用

12、抗癌藥物逐漸誘導(dǎo)的方法建立的肝癌MDR細(xì)胞株SMMC7721/ADM有明顯的優(yōu)越性；在裸鼠肝癌移植瘤模型中，HepG2/mdr1細(xì)胞組和對(duì)照HepG2細(xì)胞組的平均成瘤時(shí)間分別是13.00±2.16d和12.75±2.22d，成瘤率均為100％。給予ADM后，HepG2/mdr1細(xì)胞組移植瘤的體積增長(zhǎng)快于HepG2細(xì)胞組，其腫瘤生長(zhǎng)率為7.35±0.77和4.83±0.72，相對(duì)于HepG2/mdr1組，ADM對(duì)HepG2組腫瘤抑制率為4

13、4.6％。 結(jié)論①利用雙酶切法能夠成功構(gòu)建攜帶mdr1全長(zhǎng)基因片段的重組真核載體質(zhì)粒PCI-neo-mdr1；②目的基因mdr1cDNA在宿主細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞能夠高效表達(dá)有功能的P-gp，增加宿主細(xì)胞的MDR；③利用基因克隆的方法將mdr1cDNA導(dǎo)入HepG2細(xì)胞，建立肝癌MDR細(xì)胞株，該方法簡(jiǎn)單易行，為MDR細(xì)胞株的建立奠定一定的理論基礎(chǔ)；④利用基因克隆法建立的MDR細(xì)胞株，其MDR機(jī)理明確、單一，較體外用抗癌