PTEN基因真核表達載體的構建及在MG63中表達.pdf

1、目的：體外擴增野生型PTEN基因,克隆至真核表達載體pEGFPN1,轉染至骨肉瘤MG63細胞系,并表達出PTEN蛋白。利用此真核表達載體,為進一步探討PTEN基因在骨肉瘤發(fā)生及轉移中的價值提供實驗基礎。
　　方法：①pEGFPN1/PTEN真核表達載體的構建及鑒定:收集、純化人淋巴細胞,在無菌、無RNA酶的條件下利用 Trizol試劑提取出淋巴細胞總RNA。利用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增出PTEN基因片段,電泳分析結束

2、后回收純化 PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物與空白質粒pEGFPN1同時進行雙酶切,兩種酶切產(chǎn)物經(jīng)高保真T4 DNA連接酶作用后,轉化入感受態(tài)大腸桿菌TOP10,LB瓊脂平板中培養(yǎng)過夜。經(jīng) PCR初篩,陽性克隆通過PCR、雙酶切和測序的方式對重組載體進行鑒定,測序結果使用BLAST軟件與 GeneBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析。②MG63細胞的轉染和重組人PTEN蛋白的表達及檢測:取純化除菌的重組質粒pEGFPN1/PTEN,在轉染試劑Lipof

3、ecta mineTM2000的作用下轉染至MG63細胞。通過倒置熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光蛋白的表達情況了解轉染效率。轉染48h后收集細胞,RT-PCR和Western blot鑒定PTEN mRNA和蛋白在MG63細胞中的表達情況。
　　結果：①反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增成功獲得一具有1209bp完整開放讀碼框的PTEN的cDNA片段。成功地將其克隆入真核表達載體pEGFPN1;將構建載體pEGFPN1/PTEN

4、做EcoRI、BamH I雙酶切和PCR,分別獲得了一個大小與其相應PCR擴增產(chǎn)物一致的插入片段;經(jīng)測序及 Blast分析鑒定重組質粒構建成功。②脂質體法轉染MG63細胞24小時后可見綠色熒光蛋白的表達,48小時后收集轉染細胞,RT-PCR和Western blot鑒定重組PTEN真核表達載體在MG63細胞中能表達出PTEN mRNA和蛋白,電泳圖上可見于PTEN大小相一致的條帶,Western結果在54kD處可見陽性條帶。