Wnt-β-catenin信號通路對游離脂肪酸誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建糖原合成酶激酶3 β(GSK-3 β)特異的RNAi腺病毒表達載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制GSK-3 β基因表達，為研究Wnt/GSK-3 β/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，觀察Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號通路對高游離脂肪酸誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響。 方法： 設(shè)計合成二對針對GSK-3 β

2、mRNA不同位點的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達載體；在HEK293A細胞中包裝并擴增病毒、空斑實驗法進行病毒滴度測定；腺病毒感染HUVEC，Western Blot和免疫細胞化學法檢測其對GSK-3 β蛋白表達的抑制效應，并進一步檢測對細胞內(nèi)β-catenin蛋白水平的影響；用游離脂肪酸(FFA)培養(yǎng)細胞，RNAi腺病毒抑制GSK-3 β表達，溴脫氧尿苷(BrDU)法檢測細胞

3、增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，探討Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號通路對高游離脂肪酸作用下HUVEC增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了針對GSK-3 β基因一個位點的RNAi腺病毒表達載體，經(jīng)PCR和測序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點完全正確； 2.在HEK293A細胞中包裝、擴增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清； 3.構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3 β蛋白

4、的表達，且對GSK-3 β蛋白的抑制作用可持續(xù)六天以上； 4.構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明顯增加細胞內(nèi)β-catenin的蛋白水平，且隨著MOI值增加和時間延長β-catenin蛋白量進一步增加； 5.腺病毒和/或FFA(0.75 mmol/L)干預HUVEC，72h、96h后Brdu和流式細胞檢測，F(xiàn)FA組與正常細胞相比，細胞增殖率明顯下降，細胞凋亡率明顯增加；RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細胞增殖率明

5、顯增加，細胞凋亡率差別不明顯；RNAi腺病毒+FFA組與FFA組相比，細胞增殖率增加，細胞凋亡率減少；空病毒+FFA組與FFA組相比，細胞增殖率和凋亡率差別均不明顯。 結(jié)論： 構(gòu)建的GSK-3 β特異的RNAi腺病毒能夠有效抑制GSK-3 β基因的表達，增加細胞內(nèi)β-catenin蛋白水平，可以作為研究Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號通路的重要技術(shù)手段；上調(diào)Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號通路