樁蛋白在TEMT中的表達(dá)及金雀異黃素的干預(yù).pdf

1、目的：研究樁蛋白(paxillin，Pax)在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubularepithelialtomesenchymaltransition，TEMT)過程中表達(dá)的變化及酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)特異性抑制劑金雀異黃素(genistein，Gen)的干預(yù)結(jié)果。 方法：

2、用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液將HKC細(xì)胞接種于24孔板或培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞長到約60％～70％匯合時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，換成無血清(freeserummedium，F(xiàn)SM)同步24小時(shí)，然后分組如下：①對照(C)組：用FSM培養(yǎng)HKCs48h；②T組：用含TGF-β1的FSM培養(yǎng)HKC細(xì)胞48h，包括量效組TA組和時(shí)相組TB組，其中TA組用含有TGF-β15、10、20ng/ml的FSM培養(yǎng)HKCs48h，分為

3、T5、T10、T203個(gè)亞組；TB組用含有TGF-β110ng/ml的FSM培養(yǎng)HKCs24h、48h、72h時(shí)檢測，分為T24、T48、T723個(gè)亞組；③T+G組：10ng/mlTGF-β1和50μmol/LGen共同培養(yǎng)HKCs48h。倒置相差顯微鏡觀察HKCs的形態(tài)變化；半定量RT-PCR分析E-cadherin、alpha-smoothmuscle(α-SMA)和PaxmRNA表達(dá)的變化；免疫組化檢測E-cadherin、α-S

4、MA和Pax的蛋白表達(dá)的變化；間接免疫熒光法檢測E-cadherin、α-SMA的蛋白表達(dá)；Westernblot分析Pax蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：1、細(xì)胞形態(tài)觀察①C組：HKCs細(xì)胞呈卵石樣緊密排列生長；②TA組：24h時(shí)未觀察到明顯改變，48h時(shí)T10、T20組細(xì)胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞呈梭形，長短徑比例增加，細(xì)胞之間間隙增大，部分細(xì)胞和附近的細(xì)胞脫離接觸，失去卵石樣形態(tài)；T5組細(xì)胞部分呈現(xiàn)梭形，細(xì)胞長短徑比例增加較

5、其他兩組為??；③T+G組：細(xì)胞呈卵圓形，與C組細(xì)胞形態(tài)相似。 2、E-cadherin表達(dá)水平的檢測①C組：正常HKCs細(xì)胞大量E-cadherinmRNA的表達(dá)，蛋白表達(dá)陽性。②TA組：在不同濃度的TGF-β1刺激48h后，E-cadherinmRNA及蛋白表達(dá)較C組顯著性減少(P＜0.01)，且組間降低水平具有顯著性差異(P＜0.01)。③T+G組：E-cadherinmRNA及蛋白表達(dá)呈陽性，較T10組表達(dá)顯著升高(P＜0

6、.01)，較C組仍有顯著性差異(P＜0.01)。 3、α-SMA表達(dá)水平的檢測①C組：正常HKCs中α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)均為陰性。②TA組：在不同濃度TGF-β1刺激48h后，α-SMAmRNA及蛋白表達(dá)較C組顯著性增加(P＜0.01)，且組間增高水平具有顯著性差異(P＜0.01)。③T+G組：α-SMAmRNA及蛋白表達(dá)較T10組表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，但與C組仍有顯著性差異(P＜0.01)。 4、TG

7、F-β1對HKCs表達(dá)Paxillin的影響及Gen的干預(yù)①C組：RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示PaxmRNA和蛋白僅有微弱的基礎(chǔ)表達(dá)量，而免疫組化結(jié)果為陰性；②T組(包括TA、TB組)：TGF-β1可誘導(dǎo)HKCs的PaxmRNA及蛋白表達(dá)量較C組顯著性增加(P＜0.01)，且組間增高具有顯著性差異(P＜0.01)；③T+G組：RT-PCR結(jié)果顯示PaxmRNA僅有微弱的基礎(chǔ)表達(dá)量，Westernblot結(jié)果顯示蛋白水平的

8、Pax也為基礎(chǔ)表達(dá)量，免疫組化結(jié)果為微量的蛋白表達(dá)，均較T10組表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，與C組比較仍有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：1、PTK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與TGF-β1誘導(dǎo)的HKCs細(xì)胞發(fā)生TEMT過程； 2、TGF-β1介導(dǎo)HKCs細(xì)胞發(fā)生TEMT過程中伴隨著Pax表達(dá)增加，且具有量效和時(shí)效性； 3、PTK特異性阻斷劑Gen50μmol/L可部分抑制TGF-β110ng/ml介導(dǎo)的HKCs細(xì)胞的T

9、EMT過程以及Pax的表達(dá)。 結(jié)語 目前有關(guān)Pax的合成和降解了解甚少，Akiyama等發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)PaxmRNA表達(dá)[29]，在細(xì)胞有絲分裂時(shí)Pax降解[4]。Pax在體內(nèi)外試驗(yàn)中被選作FAC替代性標(biāo)志物[19]。Pax的酪氨酸和絲/蘇氨酸殘基磷酸化后發(fā)揮不同或相同的生物功能，也許是酪氨酸蛋白激酶和絲蘇氨酸蛋白激酶兩信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交叉點(diǎn)之一，尚待進(jìn)一步深入探究。 腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointer

10、stitialfibrosis，TIF)是慢性腎臟病的共同途徑，TIF動物模型及臨床研究均顯示纖維母細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均可由腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)EMT而來。TGF-β1己成為公認(rèn)的誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵的介導(dǎo)因子，近來研究顯示ILK是其潛在的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子[30]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)PaxmRNA表達(dá)[29]，刺激Pax磷酸化水平增加[3]且促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變[15]。另有研究表明ILK能特異性結(jié)合于Pax的LD1基序調(diào)節(jié)相互信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[31