斯氏按蚊差異表達蛋白與約氏瘧原蟲卵囊黑化關系及信號調控機制研究.pdf

1、黑化包裹是按蚊抗瘧原蟲的一種特異的防御機制,可能是瘧原蟲表面分子與可溶性模式識別受體結合而觸發(fā),并激活絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)級聯,最終導致前酚氧化酶(PPO)的分解激活酚氧化酶(PO),PO和其它蛋白質發(fā)生交聯而黑化包裹瘧原蟲.但還不知道PPO是如何到中腸組織內的,如何發(fā)生蛋白酶級聯的,以及如何參與雌按蚊內瘧原蟲卵囊黑化過程的.瘧原蟲在按蚊中腸內外經歷了配子體、合子、動合子和卵囊4個階段,卵囊成熟后,子孢子

2、逸出最后到達唾液腺而發(fā)育為感染期.斯氏按蚊是約氏瘧原蟲的易感媒介,卵囊很少黑化,該文利用斯氏按蚊吸飼硝喹乙酸鹽(Nitroquine acetate,NA)誘導產生約氏瘧原蟲卵囊黑化模型,在血細胞或中腸差異表達的黑化相關蛋白或基因分析基礎上初步探討誘導黑化及其信號調控機制.1.我們利用光鏡和透射電子顯微鏡觀察到用藥誘導后的約氏瘧原蟲卵囊黑化顆粒,中腸代謝和超微結構異常改變,細胞間隙增寬.2.利用Bradford法測定不同食源條件下斯氏按

3、蚊雌蚊血淋巴和中腸蛋白濃度差異.統(tǒng)計學分析發(fā)現,NA組血淋巴蛋白濃度顯著下降,而IB和NA組間中腸蛋白濃度無顯著性差異.3.血淋巴SDS-PAGE顯示NA、IB、NB和S組均可見到數十條蛋白帶,分子量在160kDa和66kDa蛋白差異非常明顯,吸正常血及感染1d后66kDa蛋白表達增加,感染6~8d稍減弱,用藥1、2d稍增強,3d開始下降.而160kDa蛋白在吸正常血及感染1d后呈上調表達,以后減弱.4.對NA和IB組血淋巴和中腸蛋白進

4、行2-DE和考馬斯亮藍染色,然后利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜的肽質量指紋圖譜從15個血淋巴差異蛋白中初步鑒定出一種SP.利用抗岡比亞按蚊SP22D和PPO抗體進行Western印跡發(fā)現在NA和IB組蚊存在SP22D和PPO蛋白,約氏瘧原蟲感染后斯氏按蚊血淋巴SP22D和PPO表達增強,至6d達到峰值,在NA處理卵囊黑化過程中表達逐漸下降,但是黑化后斯氏按蚊中腸PPO含量呈現上升趨勢.2-DE和Western印跡提示雌斯氏按蚊成蚊

5、血淋巴內存在PPO和SP22D基礎性表達,PPO和SP22D在體時可能均是以二聚體形式存在.約氏瘧原蟲感染后,雌斯氏按蚊成蚊血淋巴內PPO和SP22D水平是上升的,約氏瘧原蟲卵囊黑化后二者呈現下降表達,而中腸內PPO卻升高.2-DE及PMF發(fā)現,用藥后中腸糖代謝、結構和細胞信息聯系等蛋白表達水平下降.5.利用PPO和SP兼并引物和RT-PCR技術,成功地從斯氏按蚊雌成蚊全蚊、血淋巴或中腸內克隆到差異表達PPO1、SP1 和SP2基因,三

6、基因均呈現基礎性表達,但是吸正常鼠血、約氏瘧原蟲感染血或用藥誘導卵囊黑化后表達水平上表現不同程度的差異,吸正常鼠血、感染血或用藥后SP1,PPO1和SP2表達均上調,尤其感染及用藥后更明顯.ISH進一步證實PPO1、SP1 和SP2均表達于血淋巴和中腸細胞內.6.在約氏瘧原蟲感染及黑化期間,轉錄因子Relish也隨斯氏按蚊食源的不同而發(fā)生基因轉錄水平的變化.吸正常小鼠血24h Relish轉錄呈輕微上調,吸感染血6h、12h、24h或4

7、8h的Relish表達均明顯增加,吸感染血5d和6d的Relish表達逐漸下降而趨近吸糖水水平,然而,吸NA糖水12h或24h的Relish表達呈中等水平增加.研究結果表明,PPO和SP兩種蛋白酶是約氏瘧原蟲卵囊黑化通路中重要的成分,可能同時在參與卵囊黑化包裹反應中發(fā)揮了重要作用.從時相點分析,Relish轉錄因子很可能參與PPO級聯的轉錄調控.NA導致約氏瘧原蟲和/或斯氏按蚊中腸上皮細胞的化學損傷可能是黑化的始動原因,可能抑制約氏瘧原