Toll樣受體4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核源性巨噬細胞上的表達以及在其產(chǎn)生白介素6上的作用.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，免疫細胞的功能紊亂及免疫因子的網(wǎng)絡失衡在狼瘡的病理過程中起重要的作用。經(jīng)檢測SLE患者外周血和病理組織中有多種免疫因子表達水平異常，其中白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）在SLE中占有重要的一席。IL-6是一個多效的細胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應中具有廣泛的生物學活性?？梢詫е翨淋巴細胞分化為抗體形成細胞，并促使T細胞成為效應細胞。IL-6具有很多強大的促炎癥效應。在

2、狼瘡鼠的模型中，阻斷IL-6可以改善各種模型鼠的病情。最近的數(shù)據(jù)表明IL-6在B細胞的高度活化和人類狼瘡的免疫病理和組織損傷中具有重要的作用。SLE患者外周血中IL-6自發(fā)性水平升高，其機制尚不明確。 細菌，尤其是格蘭氏陰性菌以及病毒感染是狼瘡誘發(fā)和加重過程中的重要因素。但是，是否感染是確切的SLE誘發(fā)因素以及感染是如何誘發(fā)SLE患者發(fā)生免疫紊亂的，目前尚有爭議。哺乳動物感知外來微生物的入侵主要是依靠模式識別受體（pattern

3、 recognized receptors,PRRs），其中最重要的PRRs就是Toll樣受體（toll like receptors,TLRs）。Toll樣受體4（TLR4）是近年來發(fā)現(xiàn)的識別格蘭氏陰性菌產(chǎn)物脂多糖（lipopolysaccbaride，LPS）的一種主要蛋白，是橋接機體天然抗感染反應及適應性免疫的一種重要的分子。本研究的目的是：1.評價人外周血單核細胞源性的巨噬細胞的TLR4的表達情況，探討感染和SLE的關(guān)系。2.初

4、步研究TLR4在感染引起機體免疫反應中的作用和信號傳導，提出在細胞水平阻斷感染引起狼瘡異常免疫反應的可能性，并為控制狼瘡的病理提供可能的治療靶點。 實驗一 TLR4介導LPS對于外周血單核細胞源性的巨噬細胞的激活 目的:探討TLR4在LPS激活巨噬細胞中的作用及信號轉(zhuǎn)導途徑。 方法:分離正常外周血中單核細胞，體外培養(yǎng)成巨噬細胞，分為3組：1.培養(yǎng)基組。2.LPS組，細胞培養(yǎng)30min后加入終濃度10ng

5、/ml 的LPS培養(yǎng)過夜。3.培養(yǎng)基+ LPS+TLR4阻斷劑。細胞加入終濃度分別為5μg/mL, 20μg /mL, 30μg /Ml的TLR4阻斷劑孵育30min, 120min后中止反應，再加入10ng/ml 的LPS培養(yǎng)過夜。所得細胞分別檢測NF-κB的活性變化，并在上述分組細胞培養(yǎng)8h后收集上清液，ELISA法測IL-6濃度。 結(jié)果:培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基+TLR4阻斷劑(終濃度分別為和5μg/mL

6、, 20μg /mL, 30μg /mL)組NF-κB相對活性分別為27.7±3.3，76.6±11.1,65.1±7.6；28.1±4.9,24.7±2.9。培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基+TLR4阻斷劑組(終濃度分別為5μg /mL,20μg /mL, 30μg /mL)組IL-6水平: 48.08±11.2, 2234.71±63.5, 887.09±24.8,348.54±20.1, 299.43±19.9，組間兩兩

7、比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01). 結(jié)論:TLR4介導LPS對于外周血單核細胞源性的巨噬細胞的激活。最終激活NF-κB。TLR4的激活可以導致血清IL-6水平的升高，TLR4在感染引起IL-6的升高，并發(fā)揮其免疫效應中起關(guān)鍵的作用。 實驗二 SLE患者外周血單核細胞源性的巨噬細胞TLR4 mRNA變化及其意義 目的: 探討SLE患者外周血單核細胞源性的巨噬細胞TLR4變化規(guī)律及意義，為感染

8、與SLE發(fā)病的聯(lián)系尋找進一步的理論依據(jù)。 方法: 選取SLE病人17例。清晨空腹抽取外周靜脈血10ml，分離單個核細胞(PBMC)及進一步分離單核細胞，與上個實驗相同的條件體外培養(yǎng)成巨噬細胞。同樣分為培養(yǎng)基組和LPS+培養(yǎng)基組。RT-PCR檢測細胞TLR4 mRNA的表達化；ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度變化。 結(jié)果:與正常組比較，SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞TLR4的表達上調(diào)，IL-6的濃度升高（P<

9、0.05）。且在LPS的刺激下，SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞的TLR4 mRNA和IL-6也均升高。 結(jié)論: SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞的TLR4介導SLE的炎癥反應，其表達數(shù)量與機體免疫狀態(tài)有關(guān)。 實驗三 TLR4阻斷劑對SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞炎癥水平的影響 目的:驗證阻斷TLR4受體是否可以顯著降低SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞的NF-κB的活性和IL-6的產(chǎn)生，從而減

10、輕SLE異常的炎癥反應。 方法:24孔培養(yǎng)板中加入體外培養(yǎng)的SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞(2×105/孔，400μl)，分別加入等體積培養(yǎng)基、TLR4阻斷劑(終濃度分別為和5μg /mL, 20μg /mL, 30μg /mL)孵育，120min后中止反應，檢測NF-κB的活性變化和IL-6的水平變化。 結(jié)果: NF-κB的相對活性分別為30.1±7.9；27.1±4.1,25.2±2.8，22.8±2.4。各組之

11、間NF-κB的相對活性沒有顯著性變化，P>0.05。IL-6的水平分別66.11±12.2, 42.18±10.2，31.08±7.2，25.32±6.4。TLR4抗體可以顯著降低SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞IL-6的產(chǎn)生，且呈現(xiàn)劑量-效應關(guān)系，兩兩比較P<0.05。 結(jié)論:TLR4阻斷劑可以顯著影響SLE外周血單核細胞源性的巨噬細胞分泌IL-6，IL-6的產(chǎn)生的主要是TLR4依賴性的；而TLR4阻斷劑并不能顯著抑制SLE