RNA干擾抑制Nogo-A基因表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺釋放及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、第一部分 Nogo-A短發(fā)夾樣RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建靶向Nogo-A基因的短發(fā)夾樣RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體。
　　 方法：根據(jù)Gene bank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成2條shRNA，退火后克隆到pGenesil-1質(zhì)粒的U6啟動(dòng)子下游從而構(gòu)建重組載體，行限制性內(nèi)切酶酶切和基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：序列分析結(jié)果表明，兩

2、個(gè)重組質(zhì)粒的shRNA編碼序列均成功插入到預(yù)定位置。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建靶向Nogo-A的shRNA真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Nogo-A蛋白的功能及軸突再生抑制的基因治療提供了新的方法。
　　 第二部分短發(fā)夾樣RNA抑制PC12細(xì)胞Nogo-A基因表達(dá)的研究
　　 目的：研究Nogo-A shRNA對(duì)PC12細(xì)胞Nogo-A基因表達(dá)的抑制作用，為下一步探索Nogo-A的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：經(jīng)脂

3、質(zhì)體2000將前期構(gòu)建的兩個(gè)pGenesil-1/Nogo-A shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察EGFP的表達(dá)，分別于轉(zhuǎn)染后48h后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot法檢測(cè)Nogo-A Mrna及蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，空載體組的Nogo-A Mrna及蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(p>0.05)，而轉(zhuǎn)染pGenesil-1-/Nogo-A組的Nogo-A

4、 Mrna及蛋白表達(dá)水平均明顯下降(p<0.05)。
　　 結(jié)論：構(gòu)建的pGenesil-1-/Nogo-A shRNA重組質(zhì)粒能有效抑制Nogo-A基因在PC12細(xì)胞的表達(dá)。
　　 第三部分 RNA干擾抑制Nogo-A基因表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺釋放的影響
　　 目的：研究抑制Nogo-A基因表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺釋放的影響，探討Nogo-A在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的意義。
　　 方法：經(jīng)脂質(zhì)體將Nogo

5、-A shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的多巴胺釋放量。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48h后Nogo-A shRNA組細(xì)胞多巴胺釋放量明顯減少(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染空載體組多巴胺釋放量無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　 結(jié)論：Nogo-A基因沉默可以抑制PC

6、12細(xì)胞多巴胺的釋放，Nogo-A可能參與多巴胺的釋放調(diào)節(jié)。
　　 第四部分 RNA干擾抑制Nogo-A基因表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究Nogo-A基因沉默對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：應(yīng)用脂質(zhì)體將Nogo-A shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。