下調CENP-E基因表達對泛素蛋白酶抑制劑lactacystin誘導PC12細胞凋亡影響.pdf

1、一、RNA干擾技術對PC12細胞CENP-E基因表達影響觀察
　　1、目的：建立干擾CENP-E基因表達的質粒載體，轉染PC12細胞，觀察CENP-E的表達。
　　2、方法：人工合成PShRNA-CENP-E質粒1、2、3，將3種質粒，與對照組空載體質粒以脂質體轉染法共同轉染PC12細胞，在轉染24小時后用熒光顯微鏡評價轉染的效率。然后用Western bloting、免疫組化評價細胞內CENP-E表達變化。
　　3、

2、結果：成功合成的3種 PShRNA-CENP-E質粒，轉染 PC12細胞的成功率約為72.5％，Western Bloting和免疫組化示：質粒3轉染后，細胞內CENP-E的表達水平下降。
　　4、結論：PShRNA-CENP-E質粒3能特異性降低PC12細胞中CENP-E表達。
　　二、NGF誘導PC12細胞神經元樣分化及l(fā)actacystin誘導下建立帕金森細胞模型
　　1、目的：誘導 PC12長出突觸呈神經元樣化

3、，觀察不同濃度 lactacystin誘導PC12細胞凋亡情況，選擇最適合濃度構建PD細胞模型。
　　2、方法：培養(yǎng) PC12細胞，傳代后，加入終濃度為50μg/L的神經生長因子（NGF）培養(yǎng)24小時，按終濃度為0、5、10、20、30μM加入lactacystin，MTT測細胞活力，HE染色觀察細胞形態(tài)。將細胞分3組：對照組、雙蒸水組、能使細胞活力明顯下降的lactacystin最小濃度組，培養(yǎng)24小時，進行α-突觸核蛋白免疫組

4、化染色。
　　3、結果：加入NGF細胞24小時后，長出突觸，呈神經元樣分化，MTT顯示活力結果:10μM，20μM，30μM組活力明顯較對照組下降（P<0.05），HE染色示：對照組、0μM，5μM細胞突觸較長，胞體完整，10μM，20μM,30μM細胞密度降低，突觸減少或斷裂，呈凋亡樣改變。10μM lactacystin處理細胞出現α-突觸核蛋白陽性細胞。
　　4、結論：濃度為50μg/L的NGF能誘導 PC12細胞神經

5、元樣分化，lactacystin能誘導其凋亡。濃度為10μM lactacystin能明顯誘導PC12細胞凋亡，使細胞產生α-突觸核蛋白，可用于構建PD細胞模型。
　　三、下調CENP-E基因表達對泛素蛋白酶抑制劑lactacystin誘導PC12細胞凋亡影響
　　1、目的：探討下調著絲粒蛋白 E（CENP-E）基因表達是否能影響泛素蛋白酶抑制劑 lactacystin誘導 PC12細胞凋亡及細胞內其他酶的表達。該實驗為深研

6、究PD的發(fā)病機制提供理論根據。
　　2、方法：人工合成下調CENP-E的PshRNA-CENP-E質粒，采用體外培養(yǎng)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（adrenochromaffino，PC12）細胞株，共分6組，待細胞生長良好時，加入神經生長因子（NGF）培養(yǎng)24小時，按分組，對照組（A）換新鮮培養(yǎng)液；空載體轉染組（B）；下調載體轉染組（C）；lactacystin誘導細胞24小時的PD細胞模型組（D）；空載體轉染PD細胞模型組（E）；下調

7、載體轉染PD細胞模型組（F）。對各組細胞進行 MTT測細胞存活率，TUNEL檢測細胞凋亡，HE染色顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，Western blot測著酪氨羥化酶（TH）及乙酰膽堿酯酶（AchE）表達，免疫組化測細胞內 CENP-E、α-觸核蛋白、TH、AchE表達變化。
　　3、結果：
　　1、MTT檢查顯示：C、D、E、F組與對照組相比細胞活力都有明顯降低（P<0.05）。
　　2、TUNEL凋亡檢測：C、D、E、F組

8、凋亡陽性細胞數較對照組明顯增多（P<0.05）。
　　3、HE染色顯示C、D、E、F組均出現典型的細胞凋亡形態(tài)。
　　4、免疫組化示：轉染下調載體的C組 CENP-E陽性細胞數較對照組、空載體轉染組減少（P<0.05），加入lactacystin，能引起 CENP-E表達降低（P<0.05）。α-突觸核蛋白免疫組化示：A、B、C組間α-突觸核蛋白比較無差異，加入lactacystin的D、E、F組α-突觸核蛋白較前三組明顯增

9、多（P<0.05），但三組間比較無明顯差異（P>0.05）。
　　5、Western bolt證實單純下調 CENP-E后，酪氨酸羥化酶（TH）、乙酰膽堿酯（AchE）表達不受影響，但加入lactacystin后，轉入下調載體的細胞 TH、AchE表達下降，TH、AchE免疫組化提示相同結果。
　　4、結論：
　　1、PD細胞模型中 CENP-E表達較正常對照組下降。
　　2、下調CENP-E表達可降低正常PC1