煙草冷杉醇合成基因功能分析及功能標(biāo)記開發(fā).pdf

1、香氣是影響煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，明確香氣物質(zhì)合成途徑與調(diào)控基因，培育高香氣品種對煙草行業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要意義。冷杉醇屬于賴百當(dāng)二萜，是大部分香料煙和部分雪茄煙中特有的香氣前體物，其降解產(chǎn)物對增加卷煙香氣和吸味非常有效，常用于卷煙浸膏中，但烤煙、白肋煙、馬里蘭煙等一般不含有。常規(guī)育種手段由于目標(biāo)香氣性狀的鑒定費用較高等原因，冷杉醇優(yōu)異香氣性狀在烤煙香氣品質(zhì)育種中受到較大限制。此外，有研究表明冷杉醇關(guān)鍵合成基因與黑脛病抗性主效位點緊密連鎖。

2、鑒于此，本研究擬通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)明確調(diào)控冷杉醇合成的基因在烤煙中的功能以及獲得含冷杉醇的烤煙種質(zhì)的最簡單有效的轉(zhuǎn)基因模式，并鑒定冷杉醇合成基因與煙草黑脛病抗性的關(guān)系；同時開發(fā)冷杉醇關(guān)鍵調(diào)控基因的分子標(biāo)記用于種質(zhì)資源篩選與分子標(biāo)記輔助選擇育種，為下一步含冷杉醇烤煙種質(zhì)資源的創(chuàng)建及優(yōu)異烤煙品種培育提供研究基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下。
　　1.分析冷杉醇合成基因NtCPS2和NtABS在Samsun腺毛和去除腺毛葉片中相對表達量和紅花大金元腺毛和

3、去除腺毛葉片中的相對表達量。結(jié)果表明，無論在Samsun或紅花大金元中，這兩個基因在腺毛中的表達量均顯著高于去除腺毛的葉片（400-900倍），證明 NtCPS2和 NtABS是腺毛特異表達基因，且同一基因在不同品種間，兩個不同基因在同一品種間的表達具有差異性。
　　2.克隆了冷杉醇合成基因NtCPS2和NtABS，利用酶切法成功構(gòu)建了單基因NtCPS2過表達載體、單基因NtABS過表達載體和雙基因（NtCPS2和NtABS）共過

4、表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因?qū)氲郊t花大金元中。篩選得到NtCPS2陽性植株6株，NtABS陽性植株5株， NtABS和NtCPS2陽性植株4株。熒光定量PCR對陽性植株作表達量分析，篩選到相對表達量10-80倍的植株。
　　3.基于等位基因特異PCR設(shè)計了14條前引物和一條后引物，每條前引物在不同的位置引入不同的錯配堿基，共組成14對標(biāo)記引物；對比了這些引物對在親本Beinhart1000-1和Speight G-28

5、中的擴增效果，篩選到引物對1F/R1和8F/R1具有較好的特異性，同時說明在引物3'末端倒數(shù)第三位引入錯配堿基的擴增效果要好于在倒數(shù)第二位引入錯配堿基，引物3'末端連續(xù)引入兩個錯配堿基大大降低了引物與模板的結(jié)合能力；對引物對1F/R1和8F/R1進行PCR體系優(yōu)化，提高了其擴增效果；進一步在六個親本材料和F1群體驗證引物對1F/R1和8F/R1，說明其可作為分子標(biāo)記用于種質(zhì)鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種。
　　4.利用開發(fā)的兩對分子標(biāo)

6、記對47份（1-47號）主栽烤煙品種和98份高香氣EMS誘變突變體進行基因型鑒定，結(jié)合GC-MS表型鑒定和測序分析，得到4份含有冷杉醇的種質(zhì)材料，分別是大白筋599、革新三號、NC2326和一個突變體株系TBT6；進一步對48份（48-95號）烤煙種質(zhì)進行基因型鑒定，得到含有冷杉醇材料鐵耙子、86-3002、82-3041、7514、C151、7411、CV58、CF90NF、Cash、Harrison Special、SH.86-1和