大豆曲莖性狀基因定位、表達(dá)譜及候選基因功能分析.pdf

1、大豆(Glycine max(L.) Merr.)原產(chǎn)于中國(guó)，是當(dāng)今世界上最重要的植物蛋白與食用植物油的來(lái)源。我國(guó)大豆單產(chǎn)相對(duì)較低，提高產(chǎn)量是育種的首要目標(biāo)。理想株型可提高光能利用效率，是重要育種目標(biāo)，培育在群體及個(gè)體層面上與生態(tài)環(huán)境相適應(yīng)的特異株型大豆是實(shí)現(xiàn)大豆高產(chǎn)突破的重要探索途徑。曲莖是大豆株型育種中具有潛在利用價(jià)值的特異性狀。大豆曲莖短節(jié)間、稈強(qiáng)抗倒伏，可用于高產(chǎn)環(huán)境下提高植株的抗倒能力;若能將這些性狀結(jié)合到優(yōu)良的遺傳背景中，通

2、過(guò)個(gè)體和群體產(chǎn)量的協(xié)調(diào)和提高，有望達(dá)到產(chǎn)量的突破。同時(shí)大豆曲莖作為莖稈生長(zhǎng)異常突變，分離其基因可深入了解植物莖稈生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳機(jī)制。在以往研究基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步利用多個(gè)雜交組合F2群體研究曲莖遺傳，并進(jìn)行基因定位，同時(shí)利用曲莖近等基因系材料進(jìn)行表達(dá)譜差異基因分析，進(jìn)而結(jié)合基因定位和芯片結(jié)果篩選調(diào)控曲莖發(fā)育的重要基因，研究其功能。主要結(jié)果如下:
　　 對(duì)20個(gè)不同的曲莖組合進(jìn)行3正?！?曲莖和15正?！?曲莖的卡平方適合性測(cè)驗(yàn)。結(jié)

3、果有10個(gè)符合3∶1的表型分離比例，2個(gè)符合15∶1的表型分離比例，表明曲莖可能由兩對(duì)隱性基因控制;8個(gè)不符合上述分離比，可能與親本遺傳背景或外界環(huán)境因素影響有關(guān)。浙春3RH×NG94-156組合中曲莖植株株高、節(jié)數(shù)、總莢數(shù)和總粒數(shù)均顯著低于正常株，而在NN1138-2M×NG94-156組合中曲莖植株的節(jié)數(shù)和粒數(shù)與正常株無(wú)顯著差異，表明從雜交后代中可選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的曲莖短節(jié)間高產(chǎn)材料。利用曲莖NN1138-2M× NG94-156雜

4、交F2群體對(duì)曲莖基因定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，選取B2連鎖群上兩個(gè)區(qū)段（Gm14:30058525..33087558和Sat_424至染色體末端）的70個(gè)標(biāo)記進(jìn)行定位，通過(guò)結(jié)果分析最終將sb基因定位在SSR標(biāo)記BARCSOYSSR_14_1415和BARCSOYSSR_14_1424之間，其物理距離約為240kb(Gm14:47661103..47901399)，通過(guò)生物信息學(xué)分析總共預(yù)測(cè)到17個(gè)候選基因。
　　 利用大豆Affyme

5、trix基因組芯片檢測(cè)TN01大豆曲莖近等基因系莖頂端組織轉(zhuǎn)錄組差異。通過(guò)篩選（fold change＞2，P＜0.01）得到了1384個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因有899個(gè)，下調(diào)基因有485個(gè)。采用elimGO算法計(jì)算每個(gè)GO的顯著性水平，篩選差異基因所顯著影響的GO功能，共發(fā)現(xiàn)57個(gè)顯著上調(diào)、38個(gè)顯著下調(diào)的功能。篩選得到與曲莖相關(guān)的主要功能有:對(duì)赤霉素刺激的反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、細(xì)胞對(duì)重力的反應(yīng)、赤霉素介導(dǎo)的信號(hào)途徑、短日照光周期和開(kāi)花

6、的調(diào)節(jié)、對(duì)水楊酸刺激的反應(yīng)、系統(tǒng)性獲得免疫，水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)途徑、水楊酸生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)，篩選出6個(gè)與曲莖發(fā)育相關(guān)基因(Glyma14g38580、Glyma04g09350、 Glyma20g2728、Glyma11g04750、Glyma15g01500、Glyma09g27490)。采用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的顯著性水平，發(fā)現(xiàn)有10個(gè)通路顯著上調(diào)，6個(gè)顯著下調(diào);GO分析發(fā)現(xiàn)的6個(gè)基因顯著參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成、苯丙

7、氨酸的代謝、黃酮類化合物的生物合成、二萜類化合物的生物合成等途徑。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)這些基因在野生型和突變型之間發(fā)生了顯著變化，相對(duì)比較活躍。
　　 根據(jù)基因定位區(qū)段候選基因分析和表達(dá)譜芯片差異基因分析結(jié)果篩選出與曲莖發(fā)育相關(guān)重要基因Glyma14g38580，該基因編碼肉桂酸4-羥化酶(CINNAMATE-4-HYDROXYLASE，C4H)。C4H是苯丙烷途徑中第二個(gè)關(guān)鍵的酶，催化苯丙烷途徑的第二步反應(yīng)。利用10個(gè)材料進(jìn)行擴(kuò)

8、增GmC4H基因測(cè)序，結(jié)果顯示突變體和野生型之間只有堿基的差異，沒(méi)有氨基酸的差異。進(jìn)一步利用兩對(duì)近等基因系材料對(duì)該基因進(jìn)行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)該基因是下調(diào)的，其在野生和突變體中的表現(xiàn)趨勢(shì)與表達(dá)譜芯片結(jié)果一致。共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在突變體中有16個(gè)和Glyma14g38580共表達(dá)的基因，而在野生型中只有5個(gè)基因。
　　 PPR基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞器的發(fā)生過(guò)程中具有不可或缺的作用，前人研究推測(cè)GmPPR1基因可能是曲莖重要候選基