二烯丙基二硫對高表達cofilin1白血病HL-60細胞分化的影響.pdf

1、目的：研究二烯丙基二硫(DADS)對人白血病HL-60細胞中cofilin1表達以及其增殖、遷移、侵襲與分化的影響，并探討其作用的分子機制。
　　方法：RT-PCR和Western blot檢測DADS對HL-60細胞中的cofilin1及p-cofilin1表達的影響以及信號通路Rac1-ROCK1-LIMK1中各因子表達的改變。通過細胞轉染技術，將高表達cofilin1基因的重組質粒pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EG

2、FP穩(wěn)定轉染HL-60細胞，構建高表達cofilin1的HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP細胞系。RT-PCR和Western blot檢測轉染后HL-60細胞cofilin1表達的變化，并觀察DADS對高表達 cofilin1的HL-60細胞中cofilin1表達的影響；NBT細胞還原實驗、CCK-8增殖檢測實驗、Transwell遷移和侵襲實驗以及細胞免疫熒光觀察DADS對HL-60細胞及高表達 cofilin

3、1的HL-60細胞生物學特性的影響；RT-PCR和Western blot檢測DADS對高表達cofilin1的HL-60細胞Rac1-ROCK1-LIMK1信號通路的影響。
　　結果：
　　1. DADS對HL-60細胞的cofilin1表達的影響
　　RT-PCR和Western blot顯示，DADS作用HL-60細胞0h、6h、12h、24h、48h后，cofilin1和p-cofilin1在mRNA表達水平和

4、蛋白表達水平表現(xiàn)為時間依賴性的下降(P<0.05)。
　　2. DADS對HL-60細胞增殖、遷移、侵襲及還原能力的影響
　　NBT還原實驗顯示，DADS處理24h、48h、72h后，細胞對硝基藍四唑的還原能力表現(xiàn)為時間依賴性的增強(P<0.05)。CCK-8實驗顯示，DADS可呈時間依賴性的抑制HL-60細胞的增殖(P<0.05)。Transwell遷移和侵襲實驗顯示，DADS處理后，HL-60細胞的遷移、侵襲能力可呈時間

5、依賴性下降(P<0.05)。DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　3. DADS對高表達cofilin1的HL-60細胞中cofilin1表達的影響
　　構建高表達cofilin1的真核表達載體pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP，穩(wěn)定轉染HL-60細胞，RT-PCR和Western blot顯示，轉染cofilin1的高表達載體的后， HL-60細胞中cofilin1 mRNA和蛋白表達水平

6、與未轉染組及陰性轉染組細胞比較明顯上升，表明HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP細胞系構建成功。
　　RT-PCR與Western blot顯示，DADS處理前后，未轉染組、陰性轉染組及高表達組細胞的cofilin1和p-cofilin1在mRNA和蛋白表達水平具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　4. DADS對高表達cofilin1的HL-60細胞的分化的影響
　　NBT實驗結果顯示，DADS分

7、別處理未轉染組、陰性轉染組和高表達組細胞24h后，HL-60細胞對硝基藍四唑的還原能力較未處理組細胞明顯增強(P<0.05)；高表達組細胞較未轉染組及陰性轉染組細胞的還原能力明顯降低(P<0.05)，DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　CCK-8實驗結果顯示，DADS處理后，未轉染組、陰性轉染組及高表達組細胞的增殖能力較未處理的各組均減弱，且未轉染組和陰性轉染組細胞較高表達組細胞的增殖抑制更明顯(P<0.05

8、)。DADS處理組與ATRA處理組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。表明高表達cofilin1可以減弱DADS對HL-60細胞的增殖抑制作用。
　　Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示，DADS分別處理未轉染組、陰性轉染組及高表達組細胞后，其細胞穿過膜和基質膠的數(shù)量較未處理的各組細胞均減小(P<0.05)，未轉染組和陰性轉染組較高表達組穿過膜和基質膠的細胞數(shù)減少更明顯(P<0.05)。DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學差異(P>0.0

9、5)。表明高表達cofilin1可以減弱DADS對HL-60細胞的遷移、侵襲抑制作用。
　　細胞免疫熒光結果顯示，DADS處理后，未轉染組、陰性轉染組及高表達組細胞的CD11b蛋白表達水平較未處理的各組明顯上升，CD33蛋白表達水平較未處理的各組明顯下調。
　　5. DADS對HL-60細胞中的Rac1-ROCK1-LIMK1信號通路的影響
　　RT-PCR和Western blot結果顯示，DADS作用HL-60細胞

10、0h、6h、12h、24h、48h后，Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表達水平表現(xiàn)為時間依賴性的下降(P<0.05)。
　　6. DADS對高表達cofilin1的HL-60細胞的Rac1-ROCK1-LIMK1通路的影響
　　RT-PCR和Western blot結果顯示，DADS處理后，未轉染組、陰性轉染組和高表達組細胞的Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表達

11、水平較未處理的各組均顯著下降(P<0.05)。DADS處理后的高表達組細胞較DADS處理后的未轉染組和陰性轉染組細胞的Rac1、ROCK1、LIMK1、p-LIMK1的mRNA和蛋白表達水平沒有顯著變化(P>0.05)。
　　結論：
　　1. DADS可下調cofilin1活性，抑制HL-60細胞增殖、遷移與侵襲及誘導分化。
　　2．DADS拮抗Rac1-ROCK1-LIMK1通路下調cofilin1表達與磷酸化，抑制