豬圓形精細胞顯微注射受精（ROSI）及相關問題的初步研究.pdf

1、圓形精細胞卵胞質內顯微注射(Roundspermatidinjection，ROSI)輔助生殖技術的出現為治療人類男性不育提供了新的途徑。作為一種動物胚胎工程新技術，ROSI在提高動物配子利用率，獲取所需性別的動物個體、解決生產能力差的動物受精問題，尤其在作為轉基因工程的輔助技術方面都有重要應用。ROSI技術目前研究并不深入，臨床應用成功率非常低，尤其是在動物，僅僅在小鼠、兔、猴等有報道，在豬尚未見產出后代的報道，還處于探索階段。

2、 豬是多胎動物，從豬卵巢上獲得的卵母細胞數量雖然較多，但成熟度比較低；由于ROSI技術是將沒有完全發(fā)育成熟的單一圓形精細胞直接注入卵胞質內，跳越了精子在穿過透明帶和卵質膜等過程中所發(fā)生的生理和生化反應；如果卵胞質成熟或活化程度不夠，加之圓形未成熟精細胞成熟度比較差等原因，很可能造成ROSI受精的卵母細胞內部激活因子蓄積減少和生成不足，引起精核解聚困難、精圓核不能形成、第二極體不能排出、卵母細胞孤雌發(fā)育率增加等，使ROSI顯微受精失敗。

3、本試驗旨在結合豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)及ROSI相關操作，建立卵胞質內圓形精細胞顯微注射受精技術程序，探索豬圓形精細胞顯微受精的可能性，研究影響這種特殊細胞顯微注射受精效果的因素，為進一步研究豬ROSI技術提供基礎資料。 本試驗首先研究了成熟培養(yǎng)液中添加激素對豬卵母細胞體外成熟過程中染色體構型和成熟率的影響，以探索豬卵母細胞體外成熟規(guī)律，提高體外培養(yǎng)成熟度，為ROSI技術體系準備優(yōu)質卵母細胞；然后針對豬圓形精細胞的體外分離進行了試

4、驗，進而通過對ROSI操作和ICSI(Intracytoplasmicsperminjection，ICSI)操作的比較研究了影響ROSI操作的因素。研究結果如下： 試驗1：用H33342染色觀察COCs在將卵母細胞分別在三種不同培養(yǎng)環(huán)境中(FSH→不含激素、FSH→LH、FSH+LH→不含激素?！啊北硎驹谂囵B(yǎng)的第22～24h換液)其核、質成熟情況。前段培養(yǎng)24h時，含FSH組和含FSH+LH組間除了MI期卵母細胞出現比率差異

5、顯著(9.38﹪vs15.73﹪；P＜0.05)外，其余各分裂階段的分布差異不顯著，但在含FSH中培養(yǎng)24h后，GVI期卵母細胞出現比例低于FH+LH組(12.5﹪vs20.22﹪，P＞0.05)，而GVIV期卵母細胞出現比例則高于FSH+LH組(17.19vs8.99﹪，P＞0.05)。激素對卵母細胞IVM成熟比率的影響：培養(yǎng)48h后，FSH+LH→不含激素組的MII期卵母細胞的出現比率顯著高于FSH→不含激素組和FSH→LH組(55

6、.45﹪vs20.45﹪、36.62﹪，P＜0.05)；FSH→不含激素組GV期卵母細胞的比例顯著高于其余兩組(22.73﹪vs9.86﹪、4.95﹪，P＜0.05)；結果表明，豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，前24h添加FSH+LH的成熟培養(yǎng)液能夠增加GVI期、減少GVIV期卵母細胞的比例，提高了卵母細胞的發(fā)育潛力；而且，前24h使用含有FSH+LH的成熟液，后24h使用不含激素體外成熟液能夠獲得較好的卵母細胞成熟比率。 試驗2：圓

7、形精細胞分離方法研究。使用組合酶處理與單一使用膠原酶和胰蛋白酶分離圓形精細胞所耗時間差異極顯著(65.3min、83minvs112.7min，P＜0.01)；三種酶處理組獲得圓形精細胞數量近似，差異不顯著，但組合酶組稍高于單一酶處理組(7.03×105vs6.41×105、5.93×105，P＞0.05)；然而，組合酶組獲得的圓形精細胞活率略低于單一酶處理組，差異不顯著，其活率高低依次是胰蛋白酶組＞膠原蛋白酶組＞組合酶組(34.19﹪

8、＞33.36﹪＞26.96﹪)；結果表明酶消化法中用胰蛋白酶處理睪丸組織效果較好。 在試驗中用胰蛋白酶處理與睪丸直接穿刺法比較發(fā)現，胰蛋白酶處理法在花費時間、獲取圓形精細胞數量都極顯著高于睪丸直接穿刺法(83minvs25.67min、6.41×105vs30，P＜0.01)，睪丸穿刺法在獲得成活圓形精細胞的比率上極顯著高于酶處理法(100﹪vs34.19﹪，P＜0.01)。針對酶處理法和睪丸直接穿刺法獲取圓形精細胞進行ROSI

9、相比較，直接睪丸穿刺法更適合試驗室操作，而酶處理法更適宜于大批量圓形精細胞的制備。 試驗3：激活時序對豬圓形精細胞顯微注射(ROSI)效果的影響。經過試驗確定睪丸組織中平均直徑為9.4±0.1μm的類圓形細胞為圓形精子細胞；選取這種細胞進行顯微注射受精(ROSI)發(fā)現，對成熟卵母細胞實施注射前、后兩次激活的處理組出現了卵裂。 試驗4：ROSI和ICSI技術操作程序和試驗效果比較。運用常規(guī)的ICSI操作程序，對雄性配子的前

10、期準備平均時間顯著長于ROSI雄性配子的準備時間(37minvs25.67min，P＜0.05)；平均每個卵子完成注射時間ICSI組顯著長于ROSI組(7.33minvs3.33min，P＜0.05)；操作成功率無顯著差異，但ICSI組稍高于ROSI組(90﹪vs79.49﹪，P＞0.05)。對豬圓形精細胞和精子進行卵胞質顯微操作后，統(tǒng)計卵裂出現率，ICSI組卵裂率極顯著高于ROSI組(38.89﹪vs3.23﹪，P＜0.01)。結果表

11、明ROSI操作相對ICSI簡單，但卵裂率明顯低于ICSI。 綜上所述，在本試驗室條件下，豬卵母細胞在含有FSH+LH的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22-24h，然后轉入不含激素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至48h，能取得較高的成熟率；在圓形精細胞的獲取方面，直接睪丸穿刺法更適合試驗室操作，而酶處理法更適宜于生產；采用單一胰蛋白酶處理睪丸細胞懸液獲取圓形精細胞是操作比較方便、效率相對較高的方法。試驗證明豬圓形精細胞顯微注射受精(ROSI)在本試驗室條件下能