人胚胎干細胞向胰島素陽性細胞誘導分化體系的優(yōu)化.pdf

1、第一章、人胚胎干細胞(hESCs)向胰腺內分泌前體細胞誘導分化的比較
　　目的:通過比較文獻中已報道的效率較高的誘導方案，找到在本實驗室條件下獲得胰腺內分泌前體細胞的最佳誘導方案。
　　方法:體外誘導hESCs需要依次經歷限定性內胚層、胰腺內分泌前體最終才會成為胰島素陽性細胞，這是體內β細胞發(fā)育分化過程的重演。利用本實驗室已經建立好的條件，將人胚胎干細胞誘導至限定性內胚層階段。然后分三組分別用D'Amour、Hongkui

2、Deng、 Hosoya實驗室報道的誘導方案將細胞往胰腺內分泌前體誘導。在誘導的第10天以及第13天收集樣本，用免疫熒光、間標流式、real-time PCR等檢測手段比較三種誘導方案獲得胰腺內分泌前體細胞的效率。
　　結果:僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天的過程中PDX1+細胞的比例出現明顯的上調;D'Amour組呈現顯著下降趨勢;Hongkui Deng組呈現基本持平狀態(tài)。僅Hosoya小分子方案組在第10天至第

3、13天能持續(xù)檢測到較多的NGN3+細胞;D'Amour組呈現下降趨勢，且NGN3+細胞比例很低;Hongkui Deng組幾乎檢測不到NGN3+細胞。
　　結論:僅Hosoya小分子方案能更好的將限定性內胚層細胞誘導為胰腺內分泌前體細胞(PDX1+&NGN3+)。
　　第二章、人胚胎干細胞來源的胰腺內分泌前體細胞向胰島素陽性(Ins+)細胞誘導分化的研究
　　目的:比較基礎培養(yǎng)基:D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子

4、方案與Hosoya的小分子方案獲得胰島素陽性細胞的效率。
　　方法:利用第一章所得到的優(yōu)勢方案（小分子誘導方案），將hESCs誘導至胰腺內分泌前體起始階段，即誘導的第10天。然后將細胞分為兩大組，其中一組用成熟因子方案誘導，另一組繼續(xù)用 Hosoya實驗室報道的小分子方案誘導;分別考察兩種誘導方案下，基礎培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度在誘導第18天獲得Ins+細胞的差異。用免疫熒光、間標流式、real-time PCR等檢測手段比較各方案

5、獲得Ins+細胞的效率。
　　結果:高糖-DMEM加成熟因子組在誘導的第18天獲得Ins+細胞的效率最高，達27.43％±2.97％。D/F-12加成熟因子組、高糖-DMEM加小分子組和D/F-12加小分子組的Ins+細胞比例都不及21％。而追溯到誘導的第13天檢測成熟因子和小分子組在表達胰腺內分泌前體階段標記基因顯示成熟因子組PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相對表達量是小分子組的數倍結論:培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對終末形

6、成Ins+細胞效率在成熟因子組中高糖能促使β細胞增殖，低糖能使細胞內Ins含量增加;而在小分子組中無區(qū)別。在獲得Ins+細胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有優(yōu)勢，其原因可能并不是胰腺內分泌前體階段，PDX1+&NGN3+細胞數量的多少，而與其PDX1和NGN3表達量有關。推測PDX1、NGN3的表達可能存在一個閾值是激活其下游基因啟動所必須的。
　　第三章、人胚胎干細胞來源的胰腺內分泌前體細胞向胰島素陽性細胞誘導方案的

7、優(yōu)化
　　目的:以高糖-DMEM加成熟因子誘導方案為基礎優(yōu)化人胚胎干細胞來源的胰腺內分泌前體細胞向胰島素陽性細胞誘導方案。
　　方法:利用第一章所得到的優(yōu)勢方案（小分子誘導方案），將hESCs誘導至胰腺內分泌前體起始階段，即誘導的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子誘導方案為基礎進行分組，將成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1進行自由組合，分為無因子組、單因子組、雙因子組、三因子組。將細胞

8、誘導至第18天，用免疫熒光、間標流式、real-time PCR等檢測手段比較各方案獲得Ins+細胞的效率。
　　結果:在誘導第18天獲得Ins+細胞比例最高的三組分別為雙因子組中的Exendin-4&IGF-1、單因子組中的Exendin-4及IGF-1，其值分別為:32.63％±8.50％、31.60％±2.16％、30.63％±1.37％。其中單因子組中Exendin-4在real-time PCR檢測的各項胰島終末細胞標記