小鼠胚胎干細胞來源的Musashi1陽性細胞的分選及其分化能力的研究.pdf

1、哺乳動物腸腔被覆一層黏膜上皮細胞,這些黏膜上皮細胞每4-5天更新一次,這種快速更新和腸上皮干細胞密切相關(guān)。腸上皮干細胞可分化出各種腸黏膜上皮成熟細胞。腸上皮干細胞不僅在腸黏膜上皮的正常新陳代謝中起關(guān)鍵作用,而且也能修復損傷的腸黏膜上皮。如果腸上皮干細胞受到不可逆的損害,則腸道損傷黏膜的修復將變得十分困難,進而引起嚴重的全身系統(tǒng)損傷。嚴重的腸道黏膜損傷需要干細胞移植治療才可能修復。
　　 腸上皮干細胞具有增殖和自我更新的能力,又可

2、產(chǎn)生各種成熟腸上皮細胞,因此是治療腸道疾病的理想細胞。目前沒有獲取腸上皮干細胞的理想方法,最大的障礙是沒有可靠的腸上皮干細胞標志,無法獲得足夠的腸上皮干細胞用于研究和治療。研究發(fā)現(xiàn)Musashil是一個候選的腸上皮干細胞標志基因,對Musashil的研究有利于推動腸上皮干細胞和腸黏膜損傷治療的研究。
　　 Musashil蛋白是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白,是細胞不對稱分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,作為一種神經(jīng)干細胞的標志,在干細胞的維持、

3、分化和腫瘤形成中扮演重要角色。研究者注意到許多小腸黏膜隱窩表達Musashil,Musashil陽性細胞位于潘氏細胞之上并緊連于潘氏細胞的幾個細胞,Musashil陽性細胞在腸上皮隱窩的普遍表達以及合適的表達數(shù)量都暗示這些Musashil陽性細胞是腸上皮干細胞和/或者祖細胞。腸上皮干細胞在Musashil基因作用下分裂為兩個細胞:一個細胞維持干細胞性質(zhì),停留于腸上皮干細胞原來的位置,分裂產(chǎn)生的另一個細胞作為腸上皮的短暫擴增細胞。這個短暫

4、擴增細胞離開原來位置,繼續(xù)增殖并逐漸分化,產(chǎn)生潘氏細胞、吸收上皮細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和杯狀細胞。
　　 最近的研究顯示,小腸黏膜隱窩中的Musashil陽性細胞不僅僅是存在于潘氏細胞之上,也存在于潘氏細胞之間。這些細胞所處位置就是另一些新出現(xiàn)的候選腸上皮干細胞標志基因,例如leucine-rich repeat-containing G protein-coupledreceptor5(Lgr5)陽性細胞的出現(xiàn)部位。進一步證明M

5、usashil可以作為腸上皮干細胞,或者至少是祖細胞的候選基因。Musashil的進一步研究受阻于缺少足夠的Musashil陽性細胞,目前無法從腸黏膜上皮獲取足夠的Musashil陽性細胞,迫切需要獲取大量Musashil陽性細胞的方法。小鼠胚胎干細胞的研究進展為獲取大量Musashil陽性細胞提供了可能。
　　 胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有旺盛的增殖擴增能力和全能的分化能力,可發(fā)育成機體

6、所有類型細胞,在一些嚴重疾病的治療上有獨特的優(yōu)勢。經(jīng)過誘導分化或者組織工程處理后,胚胎干細胞的分化細胞可以用于治療諸如神經(jīng)變性疾病、糖尿病、心臟病、重癥肝病、燒傷等。目前,已從ESCs誘導出神經(jīng)上皮細胞、心肌細胞、血細胞、血管內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、骨細胞和胰腺β細胞等。
　　 PI3K/Akt信號通路對ESCs的自我更新、增殖和分化有重要影響。ESCs的培養(yǎng)基含有多種能激活P13K/Akt信號通路的物質(zhì),在分化過程中研究P

7、I3K/Akt信號通路顯得更為重要。抑制PI3K/Akt信號通路有利于ESCs向中內(nèi)胚層分化,從而可能分化出更多Musashil陽性細胞。
　　 我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細胞(mouse ESCs,mESCs)分化過程中有Musashil表達,如果能從mESCs分化細胞中篩選出Musashil陽性細胞,無疑將有利于對Musashil基因和腸上皮干細胞的研究。
　　 研究目的:
　　 本研究在培養(yǎng)mESCs

8、基礎(chǔ)上,在mESCs分化細胞中檢測Musashil的表達規(guī)律。構(gòu)建了Musashil啟動子報告基因載體,利用所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染mESCs分化細胞,從中篩選出Musashil陽性細胞,并對Musashil陽性細胞的分化能力做了初步研究。觀察抑制mESCs的PI3K/Akt信號通路能否增加mESCs分化過程中Musashil陽性細胞的數(shù)量。
　　 研究內(nèi)容和方法:
　　 1.采用飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層兩種方式培養(yǎng)E14tg2a系mE

9、SCs,采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)擬胚體。
　　 2.以熒光定量PCR和western blot技術(shù)在mRNA和蛋白兩個水平檢測E14tg2a細胞分化過程中Musashil的表達。
　　 3.提取和鑒定Musashil啟動子報告基因載體pMSI1-GFP。
　　 4.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),轉(zhuǎn)染pMSI1-GFP入E14tg2a分化細胞,應(yīng)用流式細胞儀檢測GFP陽性表達率。
　　 5.將pMSI1—GFP轉(zhuǎn)染入E14t

10、g2a第11天分化細胞,以流式細胞儀分選出Musashil陽性細胞。
　　 6.將分選出的Musashil陽性細胞、陰性細胞和未分選細胞繼續(xù)體外培養(yǎng),以熒光定量PCR技術(shù)檢測各組第16天分化細胞的神經(jīng)細胞標志基因(Nestin、TubulinβⅢ)和腸上皮細胞標志的基因(Musashil、Lyz、TFF3)的表達。
　　 7.將分選出的Musashil陽性細胞、陰性細胞和未分選細胞注射入NOD/SCID小鼠背部皮下,了解

11、移植物的形成能力；以熒光定量PCR技術(shù)檢測各組移植物中的神經(jīng)細胞標志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、中胚層標志基因(Pax6、PDGFR-α)和腸上皮細胞標志(Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3)的表達；以免疫組化技術(shù)檢測Nestin、Villin、FABP2的表達情況。
　　 8.探討不同濃度LY294002對E14tg2a細胞增殖的影響。以western blot檢測LY294002對E14tg2a

12、細胞糖原合成酶激酶(GSK)Ser9磷酸化蛋白的影響。
　　 9.LY294002組和EB組第5天擬胚體分化能力的檢測(GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6、Sox2)。
　　 10.流式細胞儀檢測LY294002組和EB組E14tg2a第5天分化細胞中Cxcr4陽性細胞比率。
　　 11.檢測LY294002組和EB組E14tg2a第16天分化細胞的神經(jīng)細胞標志基因(Nesti

13、n、Sox2、TubulinβⅢ)、中胚層標志基因(Pax6)和腸上皮細胞標志基因(Musashil、Lgr5、Lyz、TFF3)的表達。
　　 12.LY294002組和EB組E14tg2a分化細胞的Musashil表達及pMSI1-GFP的轉(zhuǎn)染。
　　 13.LY294002組和EB組E14tg2a第10天分化細胞注射到NOD/SCID小鼠背部皮下形成移植物。以熒光定量PCR技術(shù)檢測移植物中的神經(jīng)細胞標志基因(Nes

14、tin、TubulinβⅢ)、中胚層標志基因(Pax6、PDGFR-α)和腸上皮細胞標志基因(Musashil、Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3、Lgr5)的表達。以免疫組織化學技術(shù)檢測TubulinβⅢ和Villin蛋白的表達情況。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.在飼養(yǎng)層和非飼養(yǎng)層上均可順利培養(yǎng)E14tg2a細胞,細胞排列呈巢狀,細胞小而致密。應(yīng)用懸滴培養(yǎng)能順利產(chǎn)生擬胚體,在5x105/ml細胞濃度下,

15、所形成的胚體大小一致,邊緣光滑。
　　 2.Musashil mRNA在mESCs第11天分化細胞相對表達量達到5.54±0.19,高于其余各組。第10和11天分化細胞Musashil蛋白wesmrn blot條帶灰度分別是1.56±0.46和1.13±0.25,高于其余組。在Musashil表達最高峰后,Musashil仍在稍低水平持續(xù)表達。
　　 3.序列分析顯示所構(gòu)建的質(zhì)粒pMSI1-GFP包含Musashil啟動

16、子片段,啟動子片段插入在質(zhì)粒的多克隆位點。
　　 4.mESCs和第7、10天分化細胞轉(zhuǎn)染pMSI1-GFP,24小時后GFP陽性率分別為0.4±0.06％,0.8±0.05和25.7±6.40％。第10天分化細胞轉(zhuǎn)染后GFP陽性率最高。
　　 5.GFP陽性細胞和GFP陰性細胞的Musashil mRNA相對表達量分別為15.9±3.40和0.8±0.20；GFP陽性細胞可檢測到Musashil蛋白表達,GFP陰性細胞

17、未見Musashil蛋白。GFP陽性細胞可以認為是Musashil陽性細胞。
　　 6.在貼壁培養(yǎng)條件下,分選出的Musashil陽性和陰性細胞的神經(jīng)細胞和腸上皮細胞標志基因的mRNA表達沒有顯著性差異。
　　 7.Musashil陽性細胞組移植物Nestin、TubulinβⅢ、Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Pax6和PDGFR-αmRNA相對表達量為0.685±0.033,1.800±0.218

18、,1.119±0.209,0.281±0.028,0.0006±0.00004,0.015±0.003,0.038±0.001,0.024±0.009和0.9097±0.139；而Musashil陰性細胞組移植物相應(yīng)為0.254±0.110,1.056±0.157,0.6275±0.112,0.201±0.005,0.0002±0.0007,0.016±0.003,0.027±0.002,0.117±0.040和1.757±0.254。

19、Musashil陽性細胞組移植物神經(jīng)細胞標志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、腸上皮細胞標志基因(Vitlin、FABP2、Lyz、ChA)mRNA表達高于Musashil陰性細胞組移植物,而中胚層標志基因(Pax6、PDGFR-α)mRNA表達低于Musashil陰性細胞組移植物。
　　 8.相對于Musashil陽性細胞組,未分選細胞組和Musashil陰性細胞組移植物含有更多的軟骨樣組織。
　　 9.未分選

20、細胞組和Musashil陽性細胞組移植物的Nestin、Villin和FABP2陽性細胞表達多于Musashil陰性細胞組移植物。
　　 10.western blot條帶灰度比值(GSK-Ser9/GSK)在EB組和5μmol/L濃度LY294002組分別為0.568±0.180和0.015±0.004。5μmol/L濃度LY294002可以抑制E14tg2a細胞的PI3K/Akt信號通路。5μmol/濃度的LY294002輕

21、度抑制E14tg2a細胞的增殖。
　　 11.LY294002組第10天分化細胞Musashil mRNA相對表達量達到峰值(4.667±0.234),低于EB組第11天分化細胞Musashil mRNA相對表達量(5.540±0.190)。
　　 12.相對于mESCs,EB組第5天擬胚體的GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6和Sox2 mRNA相對表達量分別為4.575±0.894,

22、58.127±9.556,5.545±1.002,7.162±1.213,3.785±0.914,0.763±0.138和6.125±1.099；在LY294002組第5天擬胚體則分別為1.258±0.198,37.028±7.331,11.816±2.156,24.114±3.855,9.466±1.116,1.943±0.241和1.378±0.332。EB組、LY294002組分化第5天Cxcr4陽性細胞比率分別為2.13±0.6

23、5和5.90±1.24。LY294002組第5天分化細胞的內(nèi)胚層標志基因(Cxcr4、Sox17)和中胚層標志基因(Sox9、TBX6)表達高于EB組,而中內(nèi)胚層標志基因(GSC、Brachyury)和外胚層標志基因(Sox2)表達低于EB組。
　　 13.相對EB組,LY294002組分化第16天細胞的Musashil、Lgr5、Nestin、Sox2、Pax6、Lyz、TFF3、TubulinβⅢ的mRNA相對表達量分別是0

24、.428±0.105,4.832±0.622,0.268±0.035,0.327±0.093,17.500±2.443,2.353±0.246,0.050±0.010和0.126±0.023。EB組細胞的外胚層標志基因(Nestin、Sox2、TubulinβⅢ)的mRNA表達高于LY294002組,而EB組細胞的腸上皮細胞標志基因(Lgr5、Lyz)和中胚層標志基因(Pax6)的mRNA表達低于LY294002組。
　　 14

25、.EB組和LY294002組第10天分化細胞轉(zhuǎn)染pMSI1—GFP后的GFP陽性細胞率為16.54±2.76和10.04±1.98。LY294002組低于EB組。
　　 15.相對于EB組,LY294002組移植物的Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Musashil、Lgr5、Nestin、TubulinβⅢ、Pax6和PDGFR-α的mRNA相對表達量為4.422±1.233,4.362±0.897,4.40

26、5±1.004,0.786±0.194,4.877±0.727,0.881±0.217,7.318±1.352,0.336±0.062,0.567±0.105,1.895±0.335和1.893±0.294。LY294002組移植物的腸上皮細胞標志基因(Villin、FABP2、Lyz、ChA、Lgr5)和中胚層標志基因(Pax6、PDGFR-α)高于EB組,而神經(jīng)細胞標志基因(Nestin、TubulinβⅢ)低于EB組。
　　

27、 16.LY294002組移植物每個橫截面含軟骨樣組織7±2.5個,高于EB組移植物(2±1.5個)。
　　 17.LY294002組移植物表達更多的Villin陽性細胞和更少的TubulinβⅢ陽性細胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.所構(gòu)建的Musashil啟動子報告載體pMSI1-GFP能追蹤mESCs分化過程中Musashil基因的表達,并能用于從mESCs分化細胞中分選出Musashil陽性細胞。