β3腎上腺素受體激動劑對C57BL-6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)基因和microRNAs的影響.pdf

1、背景：
　　 隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活方式的改變，肥胖的患病率迅速升高，已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要的世界性公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)WHO統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，1980年以來，全球肥胖癥人數(shù)已增長了1倍。2008年全球20歲及以上的成年人中超重的人數(shù)達14億，而這些超重的人當中又有2億的男性和3億的女性為肥胖。據(jù)估計，到2030年，全球超重人口將突破21.6億，肥胖人口將達到11.2億。
　　 肥胖是高血壓、冠心病、糖尿病等疾病的危險因

2、素，WHO的相關(guān)資料表明，肥胖已經(jīng)成為當今世界第5大死亡原因。在全球范圍內(nèi)，肥胖在成人的患病率已經(jīng)超過了10％，此外，44％的糖尿病、23％的缺血性心臟病、7％-41％不同腫瘤可歸因于超重和肥胖。由此可見，肥胖已經(jīng)成為當今最迫切需要解決的健康問題之一。
　　 肥胖是在長期能量攝取超過能量消耗的情況下導致白色脂肪在機體內(nèi)沉積所致。與限制飲食相比，人們更傾向于提高能量代謝率來消耗過剩的脂肪。運動減肥是一種很好的方式，但是由于現(xiàn)代人生

3、活節(jié)奏快工作壓力大，許多人難以保證有足夠的運動量來達到減肥的目的。在治療肥胖方面，絕大多數(shù)減肥藥由于各種各樣的副作用而離開臨床應用。因此我們迫切需要找到治療肥胖的新的途徑。棕色脂肪由于其獨特的生理功能，近年來成為研究肥胖治療重要靶點。哺乳動物體內(nèi)的脂肪組織可以分為白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪是通過甘油三酯的形式儲存機體過剩的能量，并可分泌多種脂肪因子調(diào)節(jié)能量代謝。而棕色脂肪可以通過氧化游離脂肪酸產(chǎn)熱，從而維持人體在寒冷刺激時的體溫平衡，

4、或消耗機體過剩的能量達到機體的能量平衡。棕色脂肪細胞里含有很多線粒體，這些線粒體內(nèi)膜表面含有大量組織特異性非常高的解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)，UCP1能夠通過運送質(zhì)子消除線粒體跨膜電位，從而使線粒體氧化磷酸化的過程解偶聯(lián)，進而驅(qū)動脂肪消耗并以熱能的形式得到釋放。這對于機體在寒冷刺激等情況下的適應性產(chǎn)熱來說是非常重要的。不僅如此，棕色脂肪周圍還布有豐富的毛細血管，交感神經(jīng)纖維也能夠直接到達棕色脂肪組織的細胞膜上。據(jù)估計，在完全激活的情況下，

5、50g的BAT就可以消耗機體20％的基礎代謝能量。
　　 過去認為成人體內(nèi)不存在有功能的BAT，但是在2009年，5個獨立的研究組使用利用了正電子發(fā)射斷層掃描(Positron Emission Tomography，PET)和計算機斷層掃描(Computed Tomography，CT)技術(shù)證實在成人頸部和鎖骨上區(qū)域有代謝活躍區(qū)域，并取組織標本進行形態(tài)學檢查和分子標志物分析，證明這些區(qū)域里有代謝活躍的棕色脂肪組織。Cypess

6、等分析了1972位成年患者PET-CT掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5.4％的患者確實擁有棕色脂肪組織;他們還發(fā)現(xiàn)棕色脂肪組織的活性與年齡、體重指數(shù)、空腹血糖水平呈負相關(guān)，這也就是說，棕色脂肪組織與這些衡量身體健康良好與否的指標有關(guān)。成人體內(nèi)豐富的具有活性的棕色脂肪的發(fā)現(xiàn)顛覆了對棕色脂肪的認識，也開辟了從臨床醫(yī)學角度利用棕色脂肪來治療肥胖等代謝相關(guān)疾病的嶄新領域。
　　 近年來，研究人員致力于將白色脂肪細胞和其他細胞轉(zhuǎn)分化為棕色脂肪的研究。轉(zhuǎn)錄

7、因子的誘導是實現(xiàn)棕色脂肪轉(zhuǎn)分化的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ能夠體外誘導3T3L1前白色脂肪細胞轉(zhuǎn)分化成為具有棕色脂肪細胞特征的細胞群。而成肌細胞則能夠在PRDM16-C/EBPβ轉(zhuǎn)錄復合體的作用下轉(zhuǎn)分化成為具有生理功能的棕色脂肪。此外PRDM16-C/EBPβ轉(zhuǎn)錄復合體還能夠?qū)崿F(xiàn)由成纖維細胞向棕色脂肪細胞的轉(zhuǎn)分化。脂肪特異性過表達PRDM16的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)皮下白色脂肪棕色化現(xiàn)象，而內(nèi)臟白色脂肪沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
　　 m

8、icroRNA是非編碼RNA(ncRNAs)中的一種，可以在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控蛋白表達。哺乳動物體內(nèi)的microRNAs調(diào)節(jié)超過60％的編碼蛋白的基因，而一種microRNA可以調(diào)控數(shù)百種不同基因的mRNA。microRNA在脂肪細胞的轉(zhuǎn)分化過程中也能起到非常重要的作用。脂肪特異性過表達miR-196a的轉(zhuǎn)基因小鼠中，皮下白色脂肪和內(nèi)臟白色脂肪都出現(xiàn)明顯的棕色化。Sun等發(fā)現(xiàn)在C2C12肌原細胞系中過表達miR-193b/365，可以誘

9、導分化棕色脂肪細胞;而在棕色脂肪前體細胞中敲除miR-193b/365，可以誘導分化為肌細胞。而2013年最新的研究結(jié)果表明，miR-133能夠通過調(diào)控PRDM16實現(xiàn)由肌細胞向棕色脂肪細胞的轉(zhuǎn)分化。最近的研究也揭示了miR-155是棕色脂肪重要的“microRNA開關(guān)”。miR-155轉(zhuǎn)基因小鼠中UCP1表達受到抑制，miR-155敲除小鼠中UCP1表達則被激活。
　　 從能量平衡的角度看，通過增加產(chǎn)熱從而提高能量的消耗來減輕

10、體重，可以作為為一種抵抗肥胖的重要手段。在成年人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有活性的棕色脂肪后，研究人員就希望能夠通過調(diào)節(jié)棕色脂肪的產(chǎn)熱功能來治療及預防肥胖和其相關(guān)的疾病。展望未來，有兩種途徑來增加棕色脂肪的總量和活性:一是通過小分子藥物或者生長因子來刺激體內(nèi)棕色脂肪的生長分化和激活;二是通過體外誘導干細胞分化成棕色脂肪細胞，然后植入肥胖患者體內(nèi)，從某種意義上說就是脂肪組織移植。
　　 由于肥胖已經(jīng)成為現(xiàn)代社會中嚴重危害健康的公共衛(wèi)生問題。如前所

11、述，肥胖與棕色脂肪有著相當緊密的聯(lián)系。MicroRNA可以通過抑制翻譯的過程或者使mRNA降解而廣泛地參與到機體發(fā)育、細胞增殖和凋亡等過程中。近來，研究人員發(fā)現(xiàn)microRNA在白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)分化過程中也起著重要的作用。然而是否存在更多的microRNA能夠促進白色脂肪棕色化仍需要進一步探討。UCP1是棕色脂肪適應性產(chǎn)熱的關(guān)鍵基因，但關(guān)于調(diào)控UCP1的microRNA的相關(guān)研究較少。因此，研究以UCP1為靶基因的相關(guān)microRN

12、A可以更為深入地研究白色脂肪棕色化過程，從而為開發(fā)預防和治療肥胖的藥物打下良好的基礎。
　　 研究分為以下2部分進行:
　　 第一章、β3腎上腺素受體激動劑(CL316243)對C57BL/6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)基因的影響
　　 目的：研究β3腎上腺素受體激動劑(CL316243)處理的小鼠附睪脂肪、腹股溝脂肪、肩胛區(qū)棕色脂肪中的棕色化相關(guān)基因的mRNA表達量。
　　 方法：
　　 1.14只

13、6周齡C57BL/6 J雄性小鼠隨機分成2組，每組7只。實驗組小鼠每天腹腔注射β3腎上腺素受體激動劑CL316，243(劑量為1mg/Kg)，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水。每天注射1次，連續(xù)注射10天，取小鼠肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織、腹股溝區(qū)的皮下脂肪組織和內(nèi)臟的附睪脂肪，收集標本后立即放入-80℃保存。
　　 2.采用實時熒光定量PCR法檢測附睪脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、DIO2、CPT1B、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM

14、16、PPARγ2基因mRNA的表達量。
　　 3.采用實時熒光定量PCR法檢測腹股溝脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表達量。
　　 4.采用實時熒光定量PCR法檢測肩胛區(qū)棕色脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表達量。
　　 5.HE染色法觀察小鼠附睪脂肪細胞形態(tài)學變化。
　　 6

15、.統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，各指標數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，兩組間進行獨立樣本t檢驗。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組相比，CL316243組小鼠附睪脂肪和腹股溝脂肪中，脂肪合成相關(guān)基因PPARγ2mRNA表達顯著下調(diào)(P＜0.05)，而在棕色脂肪中PPARγ2 mRNA表達也下調(diào)，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 2.與對照組相

16、比，CL316243組小鼠附睪脂肪中，棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA、DIO2和脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT1BmRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.05);其他棕色脂肪分化相關(guān)PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16基因的mRNA表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3.與對照組相比，CL316243組小鼠腹股溝脂肪中棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA和棕色脂肪分化相關(guān)基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA表達

17、均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 4.與對照組相比，CL316243組小鼠肩胛區(qū)棕色脂肪中棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA和棕色脂肪分化相關(guān)基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA的表達均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 5.HE染色法觀察兩組小鼠附睪脂肪的形態(tài)學變化，對照組附睪脂肪呈現(xiàn)出大空泡的脂肪球，細胞核、細胞器及胞漿被擠到一側(cè)呈薄環(huán);在CL316243組附睪脂肪中，脂肪細胞較小，部分細

18、胞核位于細胞中間，脂滴分散在多房室內(nèi)。
　　 結(jié)論：
　　 1.β3腎上腺素受體激動劑CL316243可以下調(diào)腹股溝和附睪脂肪脂肪合成能力;
　　 2.β3腎上腺素受體激動劑CL316243可以使附睪脂肪棕色化、脂肪酸氧化水平提高，從而提高小鼠的能量代謝水平。
　　 第二章、β3腎上腺素受體激動劑(CL316243)對C57BL/6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)microRNAs的影響
　　 目的：初步

19、探討β3腎上腺素受體激動劑(CL316243)對以UCP1為靶基因的microRNA的影響。
　　 方法：
　　 1.以UCP1為檢索詞，在miranda數(shù)據(jù)庫進行靶向microRNA的預測，并篩選出最有可能以UCP1為靶基因的microRNA。
　　 2.采用實時熒光定量PCR法檢測腹股溝脂肪內(nèi)以UCP1為靶基因的miR-9、miR-338-3p及非相關(guān)的miR-let7g的mRNA表達量。
　　 結(jié)果