羊傳染性膿皰病毒VIR蛋白對宿主細胞p53和IFN-α的調控.pdf

1、羊傳染性膿皰病毒（orf virus, ORFV）屬于痘病毒科，副痘病毒屬，可引起一種接觸性人獸共患傳染病。ORFV主要感染山羊和綿羊，臨床上主要表現為嘴唇、鼻、口腔黏膜出現丘疹、水皰、膿皰和結節(jié)。該病發(fā)病率高，死亡率相對較低，若繼發(fā)其他病原感染則死亡率升高。人感染后主要表現為手背、指間和前臂出現皰疹和破潰。該病在世界范圍內廣泛流行，嚴重制約養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，同時也威脅相關從業(yè)人員的身體健康。
　　ORFV自身編碼一系列拮抗宿主免

2、疫應答的蛋白，導致感染后雖能引起宿主強烈的免疫反應，卻能夠反復感染同一宿主。VIR是ORFV編碼的免疫調節(jié)蛋白之一，具有拮抗干擾素（interferon, IFN）的活性，目前其作用機制尚不清楚。p53是細胞內的一種多功能蛋白，在抗病毒先天性免疫方面發(fā)揮重要作用。研究表明p53能夠抑制許多病毒的復制，且與I型IFN通路有重要的聯系。VIR對宿主細胞p53以及IFN-α是否具有調控作用是本文主要研究目的，為此本文做了以下研究：
　　

3、1. VIR蛋白對宿主細胞IFN-α的調控
　　為研究VIR蛋白對IFN-α表達的影響，本研究以山羊成纖維上皮細胞（GSFs）為對象，使用仙臺病毒（SeV）單獨刺激、SeV與VIR共同刺激GSFs，使用定量ELISA方法檢測GSFs上清中IFN-α的濃度，結果顯示VIR蛋白對SeV刺激的IFN-α表達和分泌有明顯的抑制作用。
　　2. VIR蛋白對宿主細胞p53的調控
　　首先檢測了ORFV感染細胞后p53表達水平的變

4、化，結果顯示在ORFV感染早期對p53的表達有抑制作用。將構建的VIR的真核表達載體，轉染至細胞中，研究VIR對p53表達的影響，結果顯示VIR在BHK-21細胞中表達后，p53 mRNA水平和蛋白水平明顯降低。表明ORFV對p53的抑制作用與VIR蛋白有關。
　　3. ORFV感染過程中p53對IFN-α下游干擾素刺激基因（ISGs）表達的調控
　　建立了基于VIR基因的SYBR GREEN法檢測ORFV拷貝數的方法，檢測

5、了p53表達受到抑制后，ORFV在羊皮膚成纖維細胞中的復制水平，繪制p53抑制組和p53正常對照組ORFV的生長曲線，結果表明抑制p53表達后ORFV在宿主細胞內的復制水平升高。本研究還證實抑制p53表達時，IFN-α刺激或ORFV感染后，干擾素刺激基因IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1的表達量相對于p53正常對照組表達量明顯降低。構建p53的真核表達載體轉染至BHK-21細胞中，熒光定量 PCR檢測 ISG

6、s的表達量，結果表明 IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1基因的表達量升高。將VIR質粒、p53質粒共轉染至細胞中后，細胞的IRF7，IRF9，ISG15，ISG20， GBP1，OAS1基因的轉錄水平相比只轉染p53質粒組明顯降低，表明VIR能夠抑制p53對ISGs轉錄水平的誘導。
　　全文研究結果證實ORFV編碼的VIR蛋白能抑制宿主p53基因轉錄水平和蛋白水平的表達；VIR蛋白能夠抑制宿主細胞IFN