RNAi沉默MMP-2基因對食管癌細胞增殖影響的體內實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　食管癌是有中國特色的惡性腫瘤之一。在中國的太行山區(qū)，食管癌的發(fā)病率居世界首位。雖然近年來手術及放、化療等綜合治療方法取得較大的發(fā)展，但是食管癌總的遠期生存率并沒有明顯改善，腫瘤局部侵襲及遠處轉移仍然是死亡的主要原因。腫瘤的發(fā)展過程是一個多階段、涉及多個基因參與的復雜過程，MMP-2被認為在多種惡性腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過構建慢病毒表達載體介導siRNA沉默MMP-2基因，觀察其對人食管癌KYSE15

2、0裸小鼠皮下移植瘤生長的抑制作用，為食管癌的基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1建立靶向MMP-2基因的shRNA慢病毒載體
　　設計3個靶向MMP-2基因的siRNA序列，經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫BLAST檢索，確認設計的siRNA序列無其它同源序列。對應siRNA序列設計3個shRNA對應的DNA序列。siRNA正義鏈和反義鏈之間以loop連接。構建重組質粒，經(jīng)過酶切和測序鑒定后用慢病毒包裝。將慢病毒轉染目標

3、細胞KYSE150后采用實時定量PCR方法檢測干擾效果。根據(jù)干擾效果篩選干擾效果最佳的序列進行慢病毒的大量包裝，純化后用于下一步裸鼠移植瘤的實驗。
　　2細胞增殖實驗
　　噻唑藍(MTT)法檢測細胞數(shù)目和增殖、生長能力。
　　3裸鼠成瘤預實驗
　　收集食管癌KYSE150細胞5×106個，用PBS稀釋至0.1ml，于裸鼠右側脅肋部皮下注射，構建人食管癌異種移植瘤模型。
　　4抑制MMP-2表達對人食管癌癌細

4、胞系KYSE150影響的體內實驗
　　24只裸鼠隨機分為3組，每組8只。將含有干擾MMP-2基因片段的慢病毒及含有無關序列片段的慢病毒分別轉染食管癌KYSE150細胞，轉染成功后將MMP-2 shRNA慢病毒轉染的KYSE150細胞(實驗組)、無關序列慢病毒轉染的KYSE150細胞(陰性對照組)及未轉染任何載體的KYSE150細胞(空白對照組)分別接種至裸鼠右側脅肋部皮下。觀察移植瘤的生長情況，腫瘤體積按公式計算，體積=1/2×長

5、徑×短徑2。實驗開始30天后處死裸鼠，分離皮下移植瘤計算腫瘤體積和重量。
　　結果：
　　1.構建了3個靶向MMP-2基因的RNA干擾慢病毒載體，經(jīng)測序驗證質粒構建成功。
　　2.在目的細胞中篩選有效干擾序列，RT-PCR顯示3個shRNA干擾序列對MMP-2mRNA抑制效果分別為：40.5％，41.4％，78.9％，和空白對照及陰性對照組相比MMP-2 mRNA水平明顯受到抑制(p<0.05)；western blo

6、tting顯示3個質粒干擾后MMP-2/β-actin吸光度比值分別為：0.187±0.072，0.261±0.095，0.063±0.016，和空白對照及陰性對照組比較MMP-2蛋白水平明顯受到抑制(p<0.05)，經(jīng)篩選shRNA-3為最有效的干擾序列。
　　3.逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度，病毒滴度為4.26×108 TU/ml。
　　4.細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)慢病毒介導的MMP-2基因沉默組細胞增殖能力顯著低于空白對照和

7、陰性對照組(p<0.001)。
　　5.成功建立了裸鼠食管癌細胞系移植瘤模型。和陰性對照組和空白對照組比較，RNA干擾組的腫瘤生長明顯緩慢，腫瘤體積和重量明顯縮小和減輕(p<0.05)。
　　結論：
　　1、RNA干擾的方法可以高效地沉默食管癌細胞KYSE150 MMP-2基因的表達，可作為一種基因敲除、基因治療研究的理想手段。
　　2、針對MMP-2基因設計的表達shRNA的慢病毒載體能在體外狀態(tài)下從mRNA和

8、蛋白水平特異、高效地抑制人食管癌細胞系KYSE150中MMP-2基因的表達，證明慢病毒是一種有效的RNAi傳遞載體。
　　3、細胞增殖實驗顯示靶向MMP-2的慢病毒載體轉染食管癌細胞系KYSE150后，引起其生長增殖速度明顯減慢。
　　4、沉默食管癌細胞中MMP-2基因的表達能有效抑制人食管癌裸鼠移植瘤的生長，國內外首次在活體條件下驗證了MMP-2基因對食管癌細胞的生物學行為的影響。為下一步研究奠定了基礎，MMP-2有望成為