MMP-2基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和血管形成的影響.pdf

1、研究背景：
　　由于缺少明顯的臨床癥狀、發(fā)病隱匿，多數(shù)卵巢癌病人就診時(shí)已屬晚期。盡管給予減瘤術(shù)及基于鉑類(lèi)的術(shù)后化療，患者的5年生存率仍然僅30％左右。因此，迫切需要尋找提高卵巢癌治療效果的新治療方法。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌患者死亡的主要原因。研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)在卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，它降解基底膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且釋放包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在內(nèi)的多種促腫瘤血管形成因子。MMP-2和V

2、EGF與卵巢癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。近些年來(lái)，研究顯示MMP-2的沉默可抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管形成，VEGF抑制劑貝伐單抗也被批準(zhǔn)用于晚期卵巢癌的治療，但是利用功能強(qiáng)大的RNA干擾技術(shù)抑制MMP-2基因在卵巢癌轉(zhuǎn)移和血管形成中的作用還缺少研究，本課題將對(duì)此進(jìn)行相關(guān)的研究。
　　研究目的：
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3中MMP-2基因，觀察其生長(zhǎng)、粘附、侵襲及遷移能力的變化，并檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的體

3、外血管形成能力變化，以探討MMP-2基因?qū)β殉舶┘?xì)胞轉(zhuǎn)移和血管形成的影響。
　　研究方法：
　　1.人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的培養(yǎng)：含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2. siRNA的設(shè)計(jì)、合成：設(shè)計(jì)、合成3對(duì)靶向MMP-2基因的小分子干擾RNA(siRNA)和1對(duì)陰性對(duì)照siRNA(s

4、iRNA-NC)，以與siRNA等體積的DMEM轉(zhuǎn)染作為空白對(duì)照組，利用Real-Time quantitative PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MMP-2 mRNA的表達(dá)，獲得MMP-2基因沉默效果最佳的siRNA，并用于用于后續(xù)試驗(yàn)；
　　3.用沉默效率最佳siRNA轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞，通過(guò)Real-Time quantitative PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中不同時(shí)間MMP-2和VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)。

5、
　　4.利用MTT實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)MMP-2基因沉默后OVCAR-3細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　5.利用體外粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2基因沉默后OVCAR-3細(xì)胞60 min時(shí)及90 min時(shí)的粘附能力，并計(jì)算黏附抑制率。
　　6.利用Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2基因沉默后OVCAR-3細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　7.利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2基因沉默后OVCAR-3細(xì)胞遷移能力。
　　8

6、.利用體外血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OVCAR-3細(xì)胞誘導(dǎo)的體外血管形成能力，觀察所形成的管狀結(jié)構(gòu)，計(jì)算每視野管型分支數(shù)量及其長(zhǎng)度。
　　9.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的結(jié)果以?±s表示，組間比較采用one way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染后MMP-2基因表達(dá)受到抑制，并且不同序列抑制作用不同，沉默效率最高者達(dá)77.8%，并用此序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。<

7、br>　　2.與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h實(shí)驗(yàn)組的MMP-2 mRNA水平分別下降73.8%、78.8%和78.4%，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組之間比較僅48h和72h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.654)。與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后48h實(shí)驗(yàn)組VEGF mRNA水平下降75.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　3.與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h各實(shí)驗(yàn)

8、組MMP-2蛋白表達(dá)水平分別下降72.6%、81.2%和76.4%，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較以及實(shí)驗(yàn)組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后48h實(shí)驗(yàn)組VEGF蛋白水平下降78.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　4. MTT試驗(yàn)結(jié)果提示RNA干擾MMP-2基因?qū)VCAR-3細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　5.細(xì)胞體外黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，培養(yǎng)60min時(shí)和90min時(shí)試驗(yàn)組

9、OVCAR-3細(xì)胞的粘附能力均明顯下降，粘附抑制率分別為42.1%和50.4%。各自與其陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　6.細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組(141.2±22.7)和空白對(duì)照組(140.1±24.1)相比，實(shí)驗(yàn)組(99.2±8.3)平均穿過(guò)濾膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。
　　7.體外劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RNAi干擾MMP-2基因后OVCAR-3細(xì)胞遷移能力明顯降低。劃痕后12小

10、時(shí)，實(shí)驗(yàn)組遷移距離為120±14μm,明顯低于陰性對(duì)照組(187±23μm)和空白對(duì)照組(186±17μm)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　8.體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNAi干擾OVCAR-3細(xì)胞MMP-2基因后，所獲得條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管形成能力明顯下降。與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組管狀結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度和分支數(shù)分別減少52.9%和47.5%。各自與其陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：