HOXA10在髓系白血病細胞NB4中的表達及藥物對其干預(yù)作用.pdf

1、 目的：觀察同源盒基因A10(homeobox gene A10,HOXA10)在人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)細胞系NB4細胞中的表達及全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的干預(yù)對其表達的影響,通過mRNA水平和蛋白水平研究HOXA10表達的變化趨勢,探討HOXA10介導(dǎo)白血病發(fā)生的機制并為臨床應(yīng)用ATRA治療白血病提供實驗依據(jù)。方法：1. 采用NB4細胞

2、株作為髓系白血病細胞模型,并用腫瘤細胞體外培養(yǎng)技術(shù)進行培養(yǎng)。2. 采用 CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法分別檢測不同濃度的ATRA在不同干預(yù)時間對 NB4 細胞增殖的影響,進而確定實驗最終所采取的藥物濃度以及檢測的時間點。3. 實驗分組：取對數(shù)生長期細胞106/ml,本課題共設(shè)四個組,其中實驗組加入終濃度為1.0μmol/L的ARTA干預(yù)4h、48h、96h,對照組不加藥物干預(yù)。4. 采用瑞氏染色法鑒定NB4細胞

3、并觀察經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后,隨著時間的推移NB4細胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。5. 采用實時熒光定量 PCR 法( real-time fluorescent quantitative-PCR,FQ-RT-PCR)檢測NB4細胞中HOXA10 mRNA的表達水平及ATRA干預(yù)對其表達的影響。6. 采用Western bolt法檢測HOXA10 蛋白的表達及藥物干預(yù)后的變化。7. 免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemical techni

4、que,IHC)定性定位檢測HOXA10蛋白在NB4細胞中的表達部位及藥物干預(yù)對蛋白表達強弱的影響。8. 統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)資料均行方差齊性檢驗,并用 SPSS11.5 軟件進行統(tǒng)計分析,P<0.05則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1. CCK-8試驗結(jié)果確定本實驗所采取的藥物終濃度為1.0μmol/L,檢測時間點為ATRA干預(yù)細胞后4h、48h和96h。2. 瑞氏染色結(jié)果表明實驗所培養(yǎng)的細胞為幼稚粒細胞,且經(jīng)1.0μmol/L ATRA誘

5、導(dǎo)后發(fā)生形態(tài)學(xué)上的細胞分化現(xiàn)象,在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察可見細胞核明顯縮小,核可偏向一側(cè),有分葉狀、折疊、凹陷等現(xiàn)象出現(xiàn),胞漿量增多,核質(zhì)比變小,核仁減少或消失。3. HOXA10基因在NB4細胞中高表達,且在ATRA干預(yù)細胞 4h、48h 和 96h 后基因表達呈下降趨勢,其中 48h 和 96h HOXA10 mRNA表達量較對照組明顯降低(P<0.05)。4. NB4細胞中可以檢測到HOXA10蛋白的表達,且隨著ATRA干預(yù)時間的延

6、長, HOXA10蛋白的表達量逐漸降低,其中4h組下降不明顯(P>0.05),而48h與96h組HOXA10蛋白表達量有顯著地降低(P<0.05)。5. NB4細胞中有HOXA10蛋白的表達主要位于NB4細胞的胞膜和胞漿,并在 ATRA 干預(yù)后蛋白的表達強度逐漸減弱。結(jié)論：本實驗證明HOXA10基因和蛋白在人急性髓系白血病細胞株NB4的細胞增殖過程中有表達,1.0μmol/L ATRA在誘導(dǎo)時間內(nèi)能促進NB4細胞向成熟方向分化,并能下調(diào)