舌癌Tca8113來源的exosomes誘導(dǎo)CTL抗腫瘤作用的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，在各種疾病所致的死亡中，惡性腫瘤現(xiàn)已成為主要病因。以免疫治療為基礎(chǔ)發(fā)展而來的生物治療日益受到重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，為腫瘤治療帶來了新的希望。 理想的腫瘤免疫治療策略是激發(fā)機體T細(xì)胞為基礎(chǔ)針對各種腫瘤排斥抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。近來研究發(fā)現(xiàn)Exosomes具有較好的抗腫瘤作用，是一種新型疫苗。Exosomes是小的膜性囊泡，可由許多細(xì)胞分泌，如樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。目前研究認(rèn)為：腫瘤細(xì)胞來源的Ex

2、osomes(Tumor-derived exosomes，TEXs)能誘導(dǎo)強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，產(chǎn)生有效的免疫保護性和治療性效應(yīng)，并且這種抗瘤效應(yīng)能跨越組織和MHC限制性。另外，由于腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes含有許多腫瘤細(xì)胞所共有的共同抗原，是一種具有廣泛應(yīng)用價值的新型腫瘤疫苗。同時Exosomes具有非細(xì)胞結(jié)構(gòu)、未經(jīng)基因的修飾、對機體潛在危害作用小、制備簡單易行等優(yōu)點，因而有理由相信，腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes代表了一種天然

3、的、全新的腫瘤疫苗，將成為研究新型腫瘤生物治療制劑和腫瘤疫苗的新方向。 舌癌是最常見的口腔惡性腫瘤，生存率較低。與其他惡性腫瘤一樣，舌癌患者也大都存在局部免疫缺陷的問題，因此我們設(shè)想從免疫學(xué)角度去研究治療舌癌的有效方法。我們大膽設(shè)想，舌癌細(xì)胞也會分泌exosomes，而且也同樣具有抗腫瘤活性，那么我們就可以利用exosomes來治療舌癌，為舌癌乃至其他口腔惡性腫瘤的治療開辟新途徑。本研究從舌癌細(xì)胞系Tca8113培養(yǎng)上清中分離、

4、提純及鑒定exosomes，并初步探討其抗腫瘤作用及相關(guān)機制，為進一步深入研究其抗腫瘤作用乃至臨床運用奠定基礎(chǔ)。研究目的首先研究舌癌Tca8113能否分泌exosomes，若能分泌，則進一步研究影響exosomes產(chǎn)生的可能因素，并初步觀察其是否具有抗腫瘤效應(yīng)，探討其抗腫瘤的可能機制。 第一部分 Tca8113來源exosomes的分離、純化及鑒定 1 方法: 1．1 Tca8113來源exosomes的分離、純

5、化：收集Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)上清500ml，通過連續(xù)離心及超濾法分離，純化出exosomes。 1．2 exosomes的鑒定：通過透射電鏡、考馬斯亮藍(lán)(Commassie Blue)染色、蛋白印記(Western blot)等證明所獲得物為exosomes。 2 結(jié)果: 1．1 Tca8113來源exosomes的分離、純化：通過一系列的超濾、離心，最終分離、純化出exosomes。一般而言，從500ml T

6、ca8113培養(yǎng)上清(約5×10<'8>個細(xì)胞)純化到約100μg的exosomes。 2．2 exosomes的鑒定：透射電鏡及western blot表明，所獲得物即為exosomes。 3 結(jié)論: 3．1 Tca8113能分泌exosomes。 3．2 Tca8113來源exosomes含有HSC70、TSG 101、MAGE、MHC class Ⅰ等蛋白。 第二部分 exosomes誘導(dǎo)C

7、TL體外抗腫瘤效應(yīng)研究 1 方法: 1．1 DC細(xì)胞及外周T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)：取外周靜脈血，密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，利用細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)的方式，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為不成熟的DC。 1．2 DC的致敏：在DC培養(yǎng)液中分別加入exosomes，不成熟的DC攝取抗原后，成為成熟的DC。 1．3 特異性CTL的產(chǎn)生：從外周靜脈血中獲得T淋巴細(xì)胞，加細(xì)胞因子IL-2培養(yǎng)使之增殖，并與致敏的D

8、C混合培養(yǎng)，使T淋巴細(xì)胞活化為CTL細(xì)胞。 1．4 乳酸脫氫酶法測細(xì)胞殺傷效應(yīng)：分3組：其中T1為未用腫瘤抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)的CTL；T2：負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)CTL；T3：單純培養(yǎng)的T細(xì)胞組。以上述三組T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，Tca8113細(xì)胞為靶細(xì)胞。按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書，檢測負(fù)載exosomes的DC活化的CTL的對Tca8113的殺傷效果。 1．5 ANNEXIN V和PI檢測：將負(fù)載exosomes的D

9、C誘導(dǎo)CTL與Tca8113細(xì)胞(約1×10<'6>個)以20：1加入24孔板共培養(yǎng)，約培養(yǎng)8h。并以約等量的。Tca8113細(xì)胞為陰性對照組。在上述兩組細(xì)胞加入ANNEXIN V和PI，然后用流式細(xì)胞儀檢測。 2 結(jié)果: 2．1 培養(yǎng)24h后出現(xiàn)少量懸浮細(xì)胞，但大部分細(xì)胞仍然貼壁生長：培養(yǎng)48h后，細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，同時懸浮細(xì)胞增多：培養(yǎng)3d后細(xì)胞表面伸出毛刺樣突起，且數(shù)目明顯增多，體積增大，呈集落樣生長：培養(yǎng)7d后

10、，集落分散，細(xì)胞大部分呈懸浮生長，分布較均勻，具有典型的樹突狀突起。DC的表型檢測，CD1a的陽性表達率為5.53﹪，HLA-DR的表達率為21.56﹪，其表面共刺激分子表達率為CD801.12﹪，CD86的表達率為56.79﹪，此時的DC處于非成熟狀態(tài)。負(fù)載抗原后檢測DC的表型，DC高表達抗原呈遞分子和共刺激分子，說明經(jīng)exosomes沖擊后，可以生成成熟DC。 2．2 Tca-8113細(xì)胞與負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)的C

11、TL混合共培養(yǎng)12h后，可以觀察到T細(xì)胞有圍繞癌細(xì)胞生長的趨勢，癌細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。 2．3 乳酸脫氫酶法測細(xì)胞殺傷效應(yīng)實驗結(jié)果：①效靶比為10：1時，負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)的CTL、未用exosomes負(fù)載的DC誘導(dǎo)的CTL及加IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞對。Tca-8113細(xì)胞的殺傷率，分別為(40.18±4.36)﹪、(12.46±1.75)﹪和(8.56±1.54)﹪；效靶比為20：1時，上述三組分別為：(50.27±4.

12、58)﹪、(13.53±2.01)﹪和(10.22±1.86)﹪；效靶比為40：1時，上述三組分別為：(65.04±4.70)﹪、(14.32±2.21)﹪和(11.34±2.01)﹪。②負(fù)載exosome的DC誘導(dǎo)的CTL與未用exosomes負(fù)載DC誘導(dǎo)的CTL及加IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞的殺傷率相比較，差異顯著(P<0.01，表1)。提示負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)的CTL對Tca-8113細(xì)胞有明顯的殺傷活性。 2．4

13、ANNEXIN V和PI檢測結(jié)果：陰性對照組(單純Tca8113細(xì)胞組)：AnnexinV=7.4﹪，PI=4.2﹪；實驗組(負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)CTL+Tca8113細(xì)胞組)：Annexin V=43.8﹪，PI=12.8﹪。表明負(fù)載exosomes的DC誘導(dǎo)CTL對腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷力，且其殺傷原理，既有細(xì)胞膜破裂死亡，又有通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式殺傷細(xì)胞，而且后者是主要的方式。 3 結(jié)論: 3．1 從人外